Генетика и молекулярна патология, SA патология в женска и детска болница, Северна Аделаида, Южна Австралия, Австралия

Генетика и молекулярна патология, SA патология в женска и детска болница, Северна Аделаида, Южна Австралия, Австралия

Генетика и молекулярна патология, SA патология в женска и детска болница, Северна Аделаида, Южна Австралия, Австралия

Генетика и молекулярна патология, SA патология в женска и детска болница, Северна Аделаида, Южна Австралия, Австралия

Училище по медицина, Университет в Аделаида, Аделаида, Южна Австралия, Австралия

Генетика и молекулярна патология, SA патология в женска и детска болница, Северна Аделаида, Южна Австралия, Австралия

Училище по медицина, Университет в Аделаида, Аделаида, Южна Австралия, Австралия

Адресирайте заявки за кореспонденция и повторно отпечатване до Maria Fuller, Genetics and Molecular Pathology, SA Pathology in Women and Children's Hospital, 72 King William Rd, North Adelaide, SA, Australia, 5006. E ‑ mail: [email protected] Търсене за повече статии от този автор

Генетика и молекулярна патология, SA патология в женска и детска болница, Северна Аделаида, Южна Австралия, Австралия

Генетика и молекулярна патология, SA патология в женска и детска болница, Северна Аделаида, Южна Австралия, Австралия

Генетика и молекулярна патология, SA патология в женска и детска болница, Северна Аделаида, Южна Австралия, Австралия

Генетика и молекулярна патология, SA патология в женска и детска болница, Северна Аделаида, Южна Австралия, Австралия

Училище по медицина, Университет в Аделаида, Аделаида, Южна Австралия, Австралия

Генетика и молекулярна патология, SA патология в женска и детска болница, Северна Аделаида, Южна Австралия, Австралия

Училище по медицина, Университет в Аделаида, Аделаида, Южна Австралия, Австралия

Адресирайте заявки за кореспонденция и повторно отпечатване до Maria Fuller, Genetics and Molecular Pathology, SA Pathology in Women and Children's Hospital, 72 King William Rd, North Adelaide, SA, Australia, 5006. E ‑ mail: [email protected] Търсене за повече статии от този автор

Резюме

мозъчно

Използвани съкращения

Мукополизахаридоза тип I е автозомно-рецесивно метаболитно разстройство, възникващо от абсолютен или функционален дефицит на лизозомния ензим α-L-идуронидаза, необходим за катаболизма на гликозаминогликаните, хепаран сулфата и дерматан сулфата. Следователно, тези частично разградени гликозаминогликани се натрупват в засегнатите клетки, което води до хронично и прогресивно влошаване на клетките, тъканите и органите, водещо до полиорганна недостатъчност (Neufeld and Muenzer, 2001). Въпреки че ензимната заместителна терапия е ефективна за намаляване на органомегалия, с молекулно тегло 87 kDa, рекомбинантната α-L-идуронидаза е твърде голяма, за да премине кръвно-мозъчната бариера, което я прави безполезна за безмилостната невродегенерация, присъща на тежката форма на мукополизахаридоза тип I, Синдром на Хърлер (HS) (Sifuentes и др. 2007). Съответно, неврологичното заболяване проявява прогресивен неврокогнитивен спад в ранна детска възраст, водещ до смърт в края на детството, за което няма лечение.

Нокаут миши модел на HS, създаден чрез целенасочено разрушаване на α-L-идуронидаза, показва прогресивен клиничен ход (Clarke и др. 1997; Ръсел и др. 1998). Функционалните неврокогнитивни оценки в този модел показват хипоактивност още на двумесечна възраст в нова среда, която не успява да намалее с привикване (Reolon и др. 2006; Пан и др. 2008). Задачите за паметта и ученето не са били толкова ясно дефинирани при някои отчети за увреждане при по-стари HS мишки (Wolf и др. 2011) и други, които не съобщават за разлики (Baldo и др. 2013 ). Хистопатологичните и имунохистохимични изследвания разкриват увеличени лизозоми в невроните, микроглиите и периваскуларното пространство, които прогресират с течение на времето. Активирането на глията и астроцитозата, доказателство за хронично невро възпаление, са очевидни още на четири месечна възраст, което показва, че този процес започва разумно в началото на живота. Допълнителна подкрепа за възпалителен процес се подчертава от наличието на хемокини в мозъка на HS мишки (Ohmi и др. 2003; Уилкинсън и др. 2012). Въпреки това, как тези открития са свързани с тежкия неврологичен спад, проявен в човешкия еквивалент на болестта, остава неясно.

Материали и методи

Моделът на мишка HS (Idua -/-, C57BL/6 фон) е закупен от лабораторията Jackson (Bar Harbor, ME, САЩ) и всички животински протоколи са одобрени от Комитета по етика на животните в мрежата на жените и децата. Една седмица преди чифтосването, хетерозиготни размножителни двойки бяха поставени на една от четирите диети: докозахексаенова киселина (DHA), SF07‐021 Модифицирана диета за гризачи AIN93G 7% рибено масло; линолова киселина (LA), SF07‐022 Модифициран AIN93G Диета за гризачи 7% шафраново масло; високо съдържание на мазнини (HF), AIN93G Мазнини от гризачи, съвпадащи със SF07‐021 и SF07‐022 и Reg (редовна), безмесна диета на плъхове и мишки (диети, доставени от Speciality Feeds, Glen Forrest, WA, Австралия). Потомците са генотипирани (Clarke и др. 1997) след отбиване на възраст от 3 седмици и 10 диви видове (WT) и 10 HS мишки продължиха на всяка от съответните диети, с изключение на Reg диетата, която включваше 15 HS и 15 WT мишки. Мишките бяха настанени групово (3-5 мишки на клетка) според диетата на 14/10 h цикъл светлина/тъмнина в контролирано от температурата съоръжение (22 ° C) и им беше позволено ad libitum храна и вода. Съотношението мъже към жени за всяка диета е: Reg, WT, 8: 6, HS, 5: 10; LA, WT, 6: 4, HS, 4: 6; DHA, WT, 6: 4, HS, 5: 5; HF, WT, 3: 7, HS, 7: 3.

Уча дизайн

Обща еднофазна липидна екстракция

LC-ESI-MS/MS

За анализ на ганглиозидите, 5 μL липиден екстракт се инжектира върху колоната и подвижната фаза А и В са, както е описано по-горе за сфинголипиден анализ, с изключение на 0,05% NH4OH, заменен с NH4COOH, за да се гарантира, че по-големите ганглиозиди (MW> 1000 Da) могат да бъдат количествено определени като двойно заредени йони. При инжектиране условията на подвижната фаза бяха 90% разтворител А и 10% разтворител В, който беше линейно увеличен до 30% В за 5 минути, 60% В за 8 минути и след това до 100% В за 10,5 минути. Това се поддържа в продължение на 0,5 минути, последвано от връщане до 10% В за 11 минути, което се уравновесява за 1 минута преди следващото инжектиране. Параметрите на източника бяха както следва: IS, -4500 V, завесен газ, 25 единици; газ за сблъсък, висок; газ за пулверизатор 1, 20 единици и спомагателен газ 2, 45 единици. Отделни видове ганглиозиди бяха количествено определени, като се използва непредвидено наблюдение на множество реакции (Таблица S1) в режим на отрицателни йони и концентрациите бяха изчислени чрез свързване на пиковите площи на всеки вид с пиковата площ на GM1 d18: 1/18: 0 (д3) с помощта на софтуера MultiQuant 3.0.1.

Открито поле

Локомоторната активност и изследователското поведение бяха наблюдавани, като се използва автоматизирана система за наблюдение на активността (апарат от Харвард, Холистън, МА, САЩ). Всяка мишка беше поставена поотделно в левия ъгъл на арена с отворено поле (40 × 40 см) и бе оставена да изследва свободно в продължение на 3 минути. Записано е съотношението на разстоянието в центъра и съотношението време в центъра, изразено като процент от общото. Животните бяха тествани повторно на 2, 4 и 6 месечна възраст.

статистически анализи

Разликите между HS и WT бяха анализирани за значимост, като се използва двустранен студент т‐ Тест след F‐ Тест за хомосцедастична дисперсия. Коефициентите на корелация на Пиърсън между отделните липидни видове и петте мозъчни области също бяха определени, като се използва spss версия 15.0 (IBM, Armonk, NY, USA) за софтуер за статистика на Windows.

Резултати

Регионални мозъчни ганглиозиди

Отделните видове ацилна верига на GD1, GD2, GM1, GM2 и GM3, които са количествено определени, са представени в таблица S1 и схематично на техния метаболизъм и структури, изобразени на фиг. 1. Всички видове корелират в рамките на всеки ганглиозиден клас (корелация на Пиърсън> 0.8) и d18: 1/18: 0 беше най-известната изоформа. GM1 и GD1 очевидно са най-разпространените ганглиозиди в мозъка, съдържащи> 90% както в мозъчните области на WT, така и в HS. GM1 беше значително повишен в малкия мозък на HS мишките на възраст 2 и 6 месеца, но нямаше значително повишение в другите мозъчни области (Фиг. 3). Няма разлика в концентрациите на GD1 между HS и WT и концентрациите са сходни на 2 и 6 месечна възраст (данните не са показани).

За разлика от това, имаше широко повишение на GM2, GM3, GD2 и GD3 във всичките пет мозъчни области на HS мишки в сравнение с WT още на 2-месечна възраст. Тази височина се запазва на 6-месечна възраст без допълнително увеличение (Фиг. 4). Диетичните добавки на LA успяха значително да намалят GM2 при мишките HS във всички мозъчни области, с изключение на малкия мозък и GM3, с изключение на малкия мозък и хипокампуса (стр

Регионални мозъчни синтетични предшественици

Липида а общ липиден клас, определен чрез сумиране на отделни видове.
Мозъчен ствол Cortex Cerebellum Hippocampus Subcortex WT HS WT HS WT HS WT HS WT HS
Cer 6.1 (1.1) 6,8 (0,6) 9,4 (0,9) 11 (0,3) 4,8 (0,1) 6,3 (0,2) 9,0 (0,7) 11 (1,8) 10 (1,3) 10 (0,4)
dhCer 1,0 (0,1) 1,1 (0,1) 1,1 (0,1) 1,3 (0,1) 0,7 (0,05) 0,9 (0,04) 1,2 (0,1) 1,4 (0,2) 1,4 (0,1) 1,3 (0,05)
MHC 98 (7,9) 87 (7,6) 15 (1.2) 13 (0,5) 33 (1.9) 36 (1,0) 12 (1.2) 9,5 (0,2) 40 (3,7) 34 (3.4)
THC n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
Сулфатид 65 (7,7) 55 (7.1) 17 (2.9) 12 (0,7) 22 (1,5) 24 (1.1) 28 (2.6) 27 (3,5) 35 (3,8) 29 (3,5)
Sph 0,2 (0,02) 0,2 (0,03) 0,1 (0,01) 0,1 (0,01) 0,1 (0,01) 0,1 (0,005) 0,1 (0,005) 0,1 (0,01) 0,2 (0,02) 0,1 (0,01)
Чол 746 (124) 639 (81) 398 (40) 374 (19) 336 (27) 394 (35) 465 (40) 460 (87) 532 (74) 455 (38)
  • Cer, церамид; Хол, холестерол; dhCer, дихидроцерамид; HS, синдром на Хърлер; MHC, монохексозилцерамид; Sph, сфингозин; THC, трихексозилцерамид; n.d., не е открит; WT, див тип.
  • Резултатите се отчитат като nmol/mg от общия протеин и се изразяват като средна и стандартна грешка (н = 6).
  • а общ липиден клас, определен чрез сумиране на отделни видове.

Двигателна активност

При теста на открито локомоторната и изследователската активност на HS мишките е намалена в сравнение с WT мишките (Фиг. 8). Въпреки че се очаква намаляване с възрастта (от 2 до 6 месеца) както при WT, така и при HS мишки, HS мишките, получаващи LA диета, не намаляват с възрастта. Най-драматичните резултати се наблюдават в съотношението на времето в центъра, при което HS мишките на LA до 6-месечна възраст значително надминават HS мишките на диетата Reg. Наблюдава се и тенденция към подобрение със съотношението междуцентрово разстояние, но това не достига значение (стр = 0,12). Трябва да се отбележи значително увеличение на съотношението на централното време за HS мишки на LA диета в сравнение с WT мишки на Reg диета на 6-месечна възраст. Няма разлика при WT и HS мишки на DHA или HF диета в сравнение с диетата Reg (данните не са показани).

Дискусия

Промяната в модела на експресия на ганглиозиди в развиващия се мозък до голяма степен се дължи на временната регулация на ензимите, отговорни за техния синтез, а именно ганглиозид синтазите (Yu и др. 2008). По-ранни работи предполагат, че намалената активност на невраминидазата е отговорна за повишаването на поне някои от простите ганглиозиди в HS (Walkley 2004), но напоследък се предполага комбиниран ефект от синтеза и разграждането на ганглиозидите. И двете намалена активност на невраминидазата заедно с намалена активност на GD3 и GM2/GM3 синтаза се считат за отговорни за регионалните повишения на ганглиозидите в мозъка на HS (Kreutz и др. 2013 ). Нашите резултати подкрепят тези констатации за повишения на GM2, GM3 и GD3 в хипокампуса, както и демонстрирано повишаване на GM1 в малкия мозък и кората, отбелязвайки разлика в методологията, използваната в това изследване масова спектрометрия е по-специфична и количествена от тънкослойна хроматография (TLC), използвана от Kreutz и др. ( 2013 ). Ганглиозидите обикновено са съвпадащи между мозъчния ствол, кората, малкия мозък, хипокампуса и подкортекса, като ацилните видове 18: 0 преобладават във всеки клас ганглиозиди, в съответствие с липидния профил на мозъка.

В заключение показахме, че простите ганглиозиди и прилежащият им метаболитен посредник, DHC, са повишени в мозъка на HS мишки в сравнение с WT. Диета с високо съдържание в Лос Анджелис успя да намали значително ганглиозидите от серия а и да подобри поведението на двигателната и изследователската дейност. Тъй като натрупването на ганглиозид се случва още на 2-месечна възраст и остава повишено, измерването на ганглиозид след коригираща терапия може да бъде полезно за оценка на терапевтичната полза за неврологичните прояви на ХС.

Благодарности и оповестяване на конфликт на интереси

Тази работа беше щедро подкрепена с грант за научни изследвания (MPS1‐13‐003) от Центъра за болести сираци на Университета в Пенсилвания (САЩ). Авторите декларират, че нямат конфликт на интереси.

Всички експерименти бяха проведени в съответствие с насоките ARRIVE.