По-рано показахме, че SIRT1 може да се разцепи в хрущяла по време на остеоартрит (ОА) и при възпалителни състояния. Известно е също така, че се открива в серуми при различни заболявания, както подробно описваме в раздела Дискусия в текста на ръкописа.

ntct

Какво добавя това проучване?

Това изследване добавя нов метод за откриване на разцепени варианти на Sirt1 в серумите. Ние показваме, че тези варианти са пряко свързани с дегенерацията на хрущяла, използвайки нашите генетични модели на мишки, които носят аблация на Sirt1 от хрущяла. Тези модели мишки (т.е. с аблация на Sirt1 от хрущяла), подложени на стареене или посттравматичен ОА, показват намалени нива на тези варианти в серумите, въпреки развитието на ОА. Друга новост е асоциирането на тези разцепени варианти на Sirt1 с хондрозенеза, което не е съобщено по-рано. В действителност, елиминирането на хондрогенесцентните клетки намалява вариантите на Sirt1 in vitro и in vivo.

Как може това да повлияе върху клиничната практика или бъдещите развития?

Данните тук заслужават клинични проучвания за потвърждаване на тази серумна мярка за категоризиране и стратифициране на тежестта на ОА, което може да ускори разработването на лекарства и персонализирано лекарство за страдащите от ОА. Важно е, че частта, свързана с хондрогенесценцията и приложението на сенолитично лекарство, показва, че тази серумна мярка може да предскаже ефективността на сенолитичното лекарство при ОА, което може да сведе до минимум необходимостта от образни методи за оценка на съвместните структурни промени след прилагане на лекарството, за да се разработят в крайна сметка лекарства за ОА, клинична употреба.

Заден план

Ставният хрущял е тънка хиалинова тъкан, покриваща противоположните костни краища в синовиалните стави. Той предотвратява ерозията на костите чрез абсорбиране на механични натоварвания, причинени от ежедневни дейности, и осигурява артикулация и движение на ставите без триене и без болка. загуба на ставния хрущял. Клиничните симптоми обикновено се появяват само след като хрущялът вече е необратимо разрушен. Те включват болка, рентгенографски признаци и ставен излив на открита субхондрална кост

Разрушаването на хрущяла, водещо до ОА, се дължи на прекомерно механично натоварване на ставата и на възпалителни обиди, които потискат анаболната активност на хондроцитите и предизвикват катаболни дейности.1. ставният хрущял е от полза за предотвратяване - OA.4 5 Хондросенесценцията се увеличава с възрастта, както и по време на посттравматични ставни обиди. Той допринася за постепенна загуба на тъкан, тъй като хондроцитите проявяват свързан със стареенето секреторен фенотип (SASP), които отделят проинфламаторни цитокини, които могат да засегнат несенесцентни съседни клетки.6 7

В днешно време основното предизвикателство при управлението на ОА е да се разработят лекарства, модифициращи болестта, способни да спрат прогресирането на заболяването, да обърнат увреждането на тъканите, да възстановят структурата и да облекчат симптомите. Друго голямо предизвикателство е да се идентифицират ефективни биомаркери, които отговарят на критериите за класификация на биомаркери „BIPED“, установени от Националната мрежа за здравни биомаркери за остеоартрит; включително биомаркери за тежест на болестта (B), разследваща (I), прогностична (P), ефикасност на интервенцията (E) и диагностична (D) .8 9 По-специално, докато диагностичните маркери помагат да се определи стадия на заболяването, прогностичните маркери помагат да се предскаже скорост и тежест на прогресията на заболяването.10 11 Такива маркери биха били от ключово значение за определяне на оптималното време за кандидатстващо лечение и за намаляване на необходимостта от образни методи (т.е. ЯМР или рентгенова снимка).

Натрупващите се доклади подкрепят схващането, че SIRT1, зависим от никотинамид аденин динуклеотид (NAD) ензимен регулатор на безшумен информационен регулатор 2 тип 1 деацетилаза, е от решаващо значение за поддържането на здравето на хрущяла при възрастни чрез насърчаване на оцеляването на хондроцитите и хомеостазата на извънклетъчната матрица (ECM) .12 Загуба на SIRT1 активността е описана при няколко свързани с възрастта заболявания, включително болестта на Алцхаймер13, както и диабет тип 2,14 метаболитен синдром и затлъстяване, циркулиращите нива 15 16 и SIRT1 наскоро се превърнаха в привлекателни биомаркери на такива състояния.17–19 SIRT1 е протеолитично инактивиран по време на OA.20 21 По този начин, в това проучване, ние разработихме ELISA анализ, който отличава SIRT1 N-терминален полипептид (NT) от SIRT1 C-терминални полипептиди (CT) в човешки и миши серум. Използвахме този анализ, за ​​да оценим дали серумното съотношение NT/CT SIRT1 е повишено при мишки и хора с умерен ОА и следователно може да се използва като потенциален биомаркер на заболяването в ранен, но асимптоматичен стадий на влошаване на ставите.

Материали и методи

Допълнителният онлайн S1 съдържа всички раздели материали и методи.

Допълнителен материал

Резултати

Разработване на ELISA за измерване на серумното съотношение NT/CT SIRT1

Първоначално нашата група описа CT прекъсване при SIRT1 при хора и мишки, извършено от катепсин В, 20, който се прикачва към неструктуриран домейн на веригата на SIRT1.22. Това води до човешки 75 kDa NT-непокътнат Sirt1 полипептид с нарушена деацетилазна активност. Въз основа на тези данни се предвижда, че антителата NT SIRT1 биха открили както 75SIRT1, така и flSIRT1, като се има предвид, че и двете притежават непокътнати NT домейни. През 2012 г. доклад на Chalkiadaki и Guarente показва, че HFD води до разцепване на NT-домейн на Sirt1, от каспаза 1, което води до подобен 75 kDa полипептид с непокътнат CT, във възпалена мастна тъкан. да се оценят както NT, така и CT домейните на SIRT1, за да се направи разлика между тежестта на ОА и други състояния, свързани с метаболизма на мазнините или други неизвестни състояния, причиняващи прекъсване на NT.

Съответно предположихме, че при ОА дегенерираният хрущял би допринесъл за повишен NT SIRT1 в серума. Този анализ може да измерва непокътнати SIRT1 и/или SIRT1 полипептиди, носещи или CT (aa 700-747), или NT (aa 1-131), както е илюстрирано в плочата, поставена на фигури 1A, B, и в прогнозираните резултати от анализа. на фигура 1С. Забележително е, че съотношение 1 би означавало равни концентрации на NT и CT SIRT1 полипептиди, което не е задължително да бъде пълната молекулна дължина на SIRT1. ELISA анализът е валидиран за възпроизводимост чрез% CV анализ, специфичност чрез скок в анализа и линейност чрез възстановяване на разреждане (таблица 1) и Western blot потвърждава способността на антителата да разпознават пълна дължина или 75SIRT1 (онлайн допълнителен S2).

ELISA анализ за съотношение N-терминал (NT)/С-терминал (CT) SIRT1. Разредените серумни или кондиционирани среди се инкубират с NT-реактивни или CT-реактивни антитела и концентрациите се изчисляват въз основа на съответната стандартна крива. Конфигурацията на плочата е добавена до стандартната илюстрация на кривата (A). Всяка серумна проба или се инкубира с NT-реактивно или CT-реактивно антитяло (В), където съотношението между концентрациите на NT и CT обозначава NT/CT SIRT1 съотношение. (В) Възможни сценарии, свързани с този метод ELISA: (1) равното съотношение NT и CT от 1 показва, че няма увеличение нито в двата протеинови домена на SIRT1 в изследваните проби; (2) разцепването както на NT, така и на CT домейни ще стане неоткрито; (3) повишена концентрация на NT в сравнение с концентрацията на CT, която дава стойност над 1; (4) повишена концентрация на CT в сравнение с концентрация на NT, което показва стойност по-малка от 1. По-специално, използвайки този метод, не може да се прави разлика между варианти на SIRT1 с пълна дължина и разцепени, а по-скоро NT-реактивни или CT-реактивни полипептиди на SIRT1.

Параметри за валидиране на ELISA

Серумното съотношение NT/CT SIRT1 е повишено при индуцирани от PTOA и възрастни мишки

За да оценим дали фрагментите на SIRT1 са засегнати от ОА, извършихме DMM операция на мишки от див тип (wt) (CD1/129/J), за да индуцираме посттравматичен остеоартрит (PTOA, фигура 2A, B) и сравнихме и млади (3 месеца) и стари (15 месеца) мишки (фигура 2D, E). При мишки с PTOA и тибиалното плато (TP), и бедрените кондили (FC) показват значително увеличение на тежестта на ОА в сравнение с мишки, подложени на фалшива операция (фигура 2А, В, съответно), с тежест в леки граници. Въпреки че не се открива разлика в серумното съотношение NT/CT SIRT1 на 2, 4 и 6 седмици след операцията, значително увеличение от приблизително два пъти е измерено на 8 седмици при мишки с DMM в сравнение с контролите (фигура 2C, под панелната илюстрация на експериментална настройвам). Оценяването на корелацията между тежестта на OA и съотношението NT/CT SIRT1 на отделни мишки (фигура 2G) показва по-високи стойности на корелация в DMM (горен панел) спрямо фиктивни мишки (среден панел), което показва, че PTOA е свързан с повишено съотношение NT/CT SIRT1.

Повишено съотношение N-терминал (NT)/С-терминал (CT) SIRT1 се наблюдава при умерена тежест на остеоартрит (ОА) при мишки от див тип (WT). WT (мъжки и женски) мишки Sirt1 3M бяха подложени на дестабилизация на медиалния менискус (DMM) или фиктивни процедури (вижте раздела Материали и методи, допълнителен текст 1) и евтаназирани на 4 и 8 седмици след DMM. Ставите бяха събрани и обработени за хистология (Safranin O/Бързо зелено оцветяване) и класирани за тежест на OA въз основа на Glasson et al 30, за тибиално плато (TP) или бедрен хондил (FC). Представителни раздели за всяка времева точка са представени под всяка диаграма за класиране на OA. (А) 4 седмици: фалшив, n = 7; DMM, n = 6. (B) 8 седмици: фалшив, n = 8; DMM, n = 10. (C) Индиректна ELISA на серум, получен от WT фиктивни и DMM мишки (времеви точки 2, 4, 6 и 8 седмици след процедурата, n = 7). Под графиката е дадена схема на експерименталната настройка: (D) WT (женски) мишки Sirt1 3M и 15M бяха евтаназирани, събрани и обработени стави за хистология (Safranin O/Бързо зелено оцветяване) и класирани за тежест на OA въз основа на Glasson и др. 30 (E) Представителни секции за всяка точка от времето (n = 8). (F) Индиректна ELISA на серум, получен от 3М и 15М мишки (n = 6). Под графиката има схема на експерименталната настройка. Статистическата значимост се обозначава със звездичка (*, p 2) и p стойност.

След това изследвахме дали индуцираният от възрастта ОА причинява промени в серумното съотношение NT/CT SIRT1, чрез сравняване на 3M и 15M мишки (фигура 2D, E). Резултатите показват приблизително трикратно увеличение на тежестта на ОА в TP и FC при стареене (фигура 2D), придружено с приблизително четирикратно увеличение на серумното съотношение NT/CT SIRT1 (фигура 2F, под панелната илюстрация на експериментална настройка). В заключение, увеличаването на серумното съотношение NT/CT SIRT1 е свързано както с PTOA в ранен стадий, така и с OA, свързано със стареенето. Долният панел на фигура 2G показва значителна корелация на тежестта на ОА с NT/CT SIRT1 в кохортата на застаряващите мишки.

Серумното съотношение NT/CT SIRT1 е повишено при пациенти с ОА

Анализът на кохорта от 28 пациенти (фигура 3А) показва увеличение на серумното съотношение NT/CT SIRT1 при лица с ранен ОА в сравнение със здрави донори, най-вече поради по-високи стойности на NT (NT SIRT1: p = 0,0003 не-ОА спрямо ранен ОА; NT/CT SIRT1: p = 0,019 не-ОА срещу ранен ОА). Интересното е, че стойностите на NT се повишават в синовиалната течност между здрави донори и късен ОА (SF; p = 0,018; фигура 3B). Данните за корелация на всеки вариант в серума и SF показват по-силна корелация на вариантите на NT в серума и SF, спрямо вариантите на CT (фигура 3C, ляв и среден панел). Освен това, най-силната корелация (p = 0,059) е наблюдавана за съотношението NT/CT SIRT1 при оценяване на серума и SF, като се използва индиректен метод ELISA (фигура 3С, десен панел). Тези данни вероятно показват, че вариантите на NT могат ефективно да достигнат циркулацията през ранните стадии на ОА, докато постоянното им производство в късните стадии на заболяването може да има тенденция да се натрупва в SF. Кумулативно, резултатите подкрепят схващането, че серумното съотношение NT/CT SIRT1 е предсказващо за ранен ОА и може да възникне от синовиална течност.

Вариантите на серумен SIRT1 са получени от хрущял

След това сравнихме 3,5-месечни и 16,5-месечни контролни и мутантни мишки за свързано с възрастта развитие на ОА (фигура 5А; илюстрация на експериментална настройка). И двата типа мишки развиват ОА на коляното при стареене (фигура 5В, С, съответно). Степента им на тежест на ОА е сходна, с изключение на страничното отделение, което е по-засегнато при стария мутант, отколкото контролните мишки (фигура 5D). Анализът на серума показва очаквано увеличение на стойностите на NT/CT SIRT1 при стари контролни мишки, което не се наблюдава при стари мутантни мишки (фигура 5F). Това увеличение се дължи на значително по-ниско ниво на NT вариант в мутантите, а непроменено ниво на CT вариант (фигура 5G). Фигура 5Н показва по-високи стойности на корелация при 3,5-месечни и 16,5-месечни мишки Sirt1 fl/fl (ляв панел) спрямо мишки ATC Cre Sirt1 fl/fl (десен панел), съответстващи на възрастта, при сравняване на индивидуални съотношения NT/CT SIRT1 с тежестта на OA. По този начин, подобно на модела на мишка PTOA, моделът на застаряващата мишка показва, че повишените NT/CT SIRT1 фрагменти, открити в серума на мишки с ОА, са получени от хондроцити.

Съотношението NT/CT SIRT1 в серума отразява локалния клирънс на стареещите клетки

Посттравматичният ACLT-индуциран остеоартрит (OA) увеличава серумния SIRT1 N-терминал (NT)/C-терминал (CT) Sirt1, който е намален след интраартикуларно (IA) сенолитично приложение. (A) Схема на експерименталното устройство; Мишките C57B6 на възраст 16 месеца бяха подложени на ACLT процедура и третирани 7 дни след ACLT с 5 последователни интраперитонеални инжекции на ABT263, последвани от 6 IA инжекции през ден до умъртвяване 28 дни след операцията. (B) Представителни изображения на стави, оцветени със Safranin O/Fast green от A (n = 4 за всяка група, × 10 увеличение). (C) Съотношението NT/CT SIRT1 е установено въз основа на метода на индиректния ELISA за серум на мишки в А. (D) Индивидуални нива на NT или CT за мишки в A (n = 4), нормализирано на фалшивите мишки. (E) Имунохистохимия за NT-SIRT1 на ACLT-сенолитично третирани мишки (n = 3), ACLT-третирани мишки (n = 3) и фалшиви мишки (n = 4). (F) Количествено определяне на SIRT1-положителни ядра от общата клетъчна популация на поле, в имунохистохимични секции.

Имунохистохимията на секциите на хрущялната тъкан показва двукратно намаляване на NT-SIRT1 оцветяването при третирани с носител ACTL спрямо фиктивни мишки (фигура 6Е, F). Сенолитичният клирънс доведе до увеличаване на клетъчните нива на NT-SIRT1 в сравнение с носителя, тенденция, подобна на тази, наблюдавана при по-млади мишки (3,5 месеца; допълнителен онлайн S7A). За по-нататъшна оценка на връзката между стареенето и Sirt1, изследвахме ATC Cre Sirt1 fl/fl и Sirt1 fl/fl post-DMM (онлайн допълнителен S7B, C). Резултатите показват, че DMM е допринесъл за появата на p16 INK4a (допълнителен онлайн S7B) в ставните хондроцити, в сравнение с фалшивите контроли. При сравняване на ставния хрущял след DMM от Sirt1 fl/fl с ATC Cre Sirt1 fl/fl, се оказа, че p16 INK4a положителни хондроцити са по-разпространени в ATC Cre Sirt1 fl/fl мишки (допълнителен онлайн S7B), подкрепяйки концепцията, че липсата на SIRT1 насърчава стареенето, в съответствие с други доклади.31 32 Данните също потвърждават, че прилагането на сенолитични лекарства ефективно изчиства стареещите хондроцити, като се има предвид, че SIRT1 е открит в клетките само след лечение (фигура 6Е, F).

В съответствие с предишни наблюдения, данните потвърждават, че NT SIRT1 вариантите, открити в серума, са получени от увреден хрущял, тъй като нивата им са били увеличени в серума и едновременно намалени в хрущяла по време на ACLT. Въпреки това, ACLT със сенолитично лечение намалява серумното съотношение NT/CT SIRT1 и увеличава клетъчното ниво на SIRT1 в ставния хрущял. Данните потвърждават, че посттравматичните обиди са индуцирали хондрогенесценция и са намалили нивата на SIRT1 в хондроцитите, вероятно поради локални проинфламаторни сигнали, получени от стареещи клетки, освобождаващи везикули на SASP, за които е доказано, че съдържат приемник на възпалителен медиатор, хемокини (интерлевкин (IL) 1α, IL6, CXCL-8), 33 34, които предизвикват тъканни увреждания.35 36 Въпреки че не сме тествали наличието на везикули на SASP в нашия доклад, ние предполагаме, че продължителното излагане на SASP може да предизвика апоптоза на несенесцентни клетки, което води до по-малко SIRT1- положителни клетки в ставния хрущял. Това води до повишено съотношение NT/CT SIRT1 в циркулацията.

Дългосрочната експозиция на хондроцити на възпалителни цитокини причинява клетъчна апоптоза и освобождаване на разтворими SIRT1 фрагменти

За по-нататъшно разбиране на клетъчната динамика, водеща до увеличаване на съотношението NT/CT SIRT1 в серума на пациенти с ОА, ние култивирахме човешки хондроцити, стимулирахме ги в продължение на 2 или 8 дни с фактор туморна некроза алфа (TNFα) и интерлевкин 1β (IL1β ), и оценява апоптозата на клетките и съотношението NT/CT SIRT1 в кондиционирана среда. Скоростта на клетъчна апоптоза е била четирикратно по-висока на ден 8 от експозицията на ден 2 и този резултат съвпада с трикратно увеличение на съотношението NT/CT SIRT1 (допълнителен онлайн S8A, B). Клетъчните лизати разкриват значително по-високо ниво на 75SIRT1 в клетки, стимулирани с цитокини в продължение на 2 дни, но не и в клетки, третирани в продължение на 8 дни (допълнителен онлайн S8C). Тези данни предполагат, че повишената скорост на клетъчна апоптоза, наблюдавана по време на 8 дни цитокинова инсулт, е довела до освобождаването на 75SIRT1 в кондиционирана среда (онлайн допълнителен S8B).

Благодарности

Авторите признават Ron Shahar и Maitena Dumont (Училище по ветеринарна медицина Koret, Еврейски университет в Йерусалим) за тяхната помощ при оценката, реконструкцията и анализа на µCT сканирани проби. Авторите благодарят на Christelle Sanchez (Университет в Лиеж, Белгия) и Anne-Christine Bay-Jensen и Christian S. Thudium (Nordic Bioscience, Дания) за съдействието и ръководството при валидиране на ELISA. Авторите признават подкрепата на проф. Meir Liebergall, председател на Ортопедичния хирургичен комплекс, Медицински център Hadassah, Йерусалим, Израел.