Допринесе еднакво за тази работа с: Марям Карими, Василе И. Павлов

метаболитния

Роли Концептуализация, куриране на данни, официален анализ, разследване, администриране на проекти, писане - преглед и редактиране

Отделение по хирургия, Болница Роуд Айлънд, Медицинско училище Уорън Алперт, Университет Браун, Провиденс, РИ, Съединени американски щати

Допринесе еднакво за тази работа с: Марям Карими, Василе И. Павлов

Филиал Icahn School of Medicine в планината Синай, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

Отделение по хирургия, Болница Роуд Айлънд, Медицинско училище Уорън Алперт, Университет Браун, Провиденс, РИ, Съединени американски щати

Отделение по хирургия, Болница Роуд Айлънд, Медицинско училище Уорън Алперт, Университет Браун, Провиденс, РИ, Съединени американски щати

Отделение по хирургия, Болница Роуд Айлънд, Медицинско училище Уорън Алперт, Университет Браун, Провиденс, РИ, Съединени американски щати

Отделение по хирургия, Болница Роуд Айлънд, Медицинско училище Уорън Алперт, Университет Браун, Провиденс, РИ, Съединени американски щати

Принадлежност Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, Бостън, Масачузетс, Съединени американски щати

Принадлежност Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, Бостън, Масачузетс, Съединени американски щати

Методология на ролите, ресурси

Отделение по хирургия, Болница Роуд Айлънд, Медицинско училище Уорън Алперт, Университет Браун, Провиденс, РИ, Съединени американски щати

Присъединяване Университет Индиана, Медицински факултет, Индианаполис, Индиана, Съединени американски щати

Отделение по хирургия, Болница Роуд Айлънд, Медицинско училище Уорън Алперт, Университет Браун, Провиденс, РИ, Съединени американски щати

Национална лаборатория на Лос Аламос, Лос Аламос, Ню Мексико, Съединени американски щати

Придобиване на финансиране на роли, надзор, писане - преглед и редактиране

Отделение по хирургия, Болница Роуд Айлънд, Медицинско училище Уорън Алперт, Университет Браун, Провиденс, РИ, Съединени американски щати

  • Марям Карими,
  • Василе И. Павлов,
  • Оливия Циглер,
  • Ниведета Шрирам,
  • Se-Young Yoon,
  • Вахид Агбортоко,
  • Стояна Александрова,
  • Джон Асара,
  • Франк W. Sellke,
  • Майкъл Щюрек

Фигури

Резюме

Цитат: Karimi M, Pavlov VI, Ziegler O, Sriram N, Yoon S-Y, Agbortoko V, et al. (2019) Силен ефект на метаболитния синдром върху основните метаболитни пътища в миокарда. PLoS ONE 14 (12): e0225857. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225857

Редактор: Cesario Bianchi, Universidade de Mogi das Cruzes, БРАЗИЛИЯ

Получено: 21 юни 2019 г .; Прието: 13 ноември 2019 г .; Публикувано: 2 декември 2019 г.

Наличност на данни: Данните са достъпни от присъединителен номер PRJNA544355.

Финансиране: NIH (R01HL128831 A.U .; R01HL127072-01A1, HL136347-01 за J.F .; P30DK097512 за M.S .; Национална лаборатория в Лос Аламос LDRD 20180060DR) безвъзмездно за B.S.A. Това изследване използва ресурси, предоставени от Националната лабораторна институционална изчислителна програма в Лос Аламос, която е подкрепена от Националната администрация по ядрена сигурност на Министерството на енергетиката на САЩ по договор № DE-AC52-06NA25396.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Съкращения: MetS, метаболитен синдром; LD, Lean Diet контрол; G6P, глюкоза-6-фосфат; F6P, Фруктоза 6-фосфат; AcCoA, ацетил коензим А; Пропионил КоА, пропионил коензим А; Malonyl CoA, Malonyl Coenzyme A; FBP1, фруктоза-1,6-бисфосфатаза; G3P, глицералдехид 3-фосфат; ATP, аденозин три-фосфат; G1P, глюкоза 1 фосфат; UDP-GlcNAc, уридин дифосфат N-ацетилглюкозамин; GlcNAc-1P, N-Ac-Глюкозамин-1-фосфат; PGAM1, фосфоглицерат мутаза 1; ENO1, Енолаза 1; GAPDH, глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа; CPT1A, карнитин палмитоилтрансфераза 1А; ACAT2, ацетил-КоА ацетилтрансфераза 2; FASN, Синтаза на мастни киселини; ACLY, ATP цитратна лиаза; OXCT1, 3-оксокиселина CoA-трансфераза 1; BDH1, 3-хидроксиметил-3-метилглутарил-КоА лиаза; HMGCL, 3-хидрокси-3-метилглутарил-КоА лиаза; PYGM, гликоген фосфорилаза; PHKA1, регулаторна субединица на фосфорилаза киназа алфа 1; PHKA2, регулаторна субединица на фосфорилаза киназа алфа 2; UAP1, UDP-N-ацетилглюкозамин пирофосфорилаза 1; HBP, биосинтетичен път на хексозамин; PPP, път на пентоза фосфат; NMF, факторизация на неотрицателна матрица; MetS, метаболитен синдром; OGA, O-GlcNAcase; LV, лява камера; WGA, аглутинин от пшеничен зародиш; OGT, N-ацетилглюкозаминилтрансфраза; GYG1, гликогенен биосинтез гликогенин1; PAS, Периодична киселина-шиф

Въведение

Метаболитният синдром (MetS) е установен като предшественик на сърдечната патология и е свързан с промени в сърдечния енергиен метаболизъм. Докато ролята на метаболизма в сърдечната функция е засенчена през последните 20 години с появата и популярността на генетичния анализ, сега нараства оценката за метаболитните процеси, свързани с наличието на енергиен субстрат на миокарда, които могат да допринесат за прогресирането на сърдечната патология.

MetS е група от метаболитни състояния, включително затлъстяване, хипергликемия, инсулинова резистентност, хипертриглицеридемия, повишен плазмен LDL, високо кръвно налягане и ендотелна дисфункция, които излагат пациентите на риск от сърдечни заболявания и диабет [1]. Предвид многостранния характер на MetS е малко вероятно единичните молекулни биомаркери или дисрегулация да могат адекватно да уловят или прогнозират развитието му [2]. Като такива, последните изследвания се фокусират върху прилагането на количествени методи за едновременен скрининг на голям набор от метаболити за характеризиране на вътреклетъчната метаболитна среда на MetS.

Наскоро се съобщава за целенасочени метаболомични данни за набор от полярни метаболити в кръвната плазма, главно някои аминокиселини и техните производни при пациенти със затлъстяване и MetS [3, 4]. Въпреки че метаболомичните анализи на кръв и други телесни течности дават ценни резултати, изгодно е да се анализират промените в нивото на тъканите в миокарда, предвид неговия уникален метаболизъм. Понастоящем има активно разследване за ролята на метаболитните промени в човешкия миокард, въпреки че това е възпрепятствано от трудностите, свързани с получаването на човешка тъкан [5]. Тук използваме големия животински модел на свине, който разработва отличителните критерии на човешкия MetS, за да преодолее несъответствията в боравенето с метаболити между човешки и малки животински модели и трудностите, свързани с получаването на човешка тъкан. Доказано е, че свинете Йоркшир развиват MetS, който е почти идентичен с хората, за относително кратък период от време, когато се хранят с хиперкалорична, хиперхолестеролемична диета [6, 7].

Тук използваме индуцираната от диета с високо съдържание на мазнини MetS и постно-диетичен контрол (LD) йоркширски свине, за да установим метаболитната картина на идентичността на MetS в миокарда чрез прилагане на комбиниран експериментален и неконтролиран изчислителен подход на неотрицателна матрица (NMF) съгласувана интеграция на метаболомиката с транскрипция и физиологични данни. Като цяло нашите данни и анализи предоставят картина на идентичността на MetS в миокарда и представляват основна стъпка напред в разкриването на цели за намеса и контрол на процесите на миокардното заболяване в MetS.

Резултати

Влиянието на хиперкалоричната хиперхолестеролемична диета върху рисковите фактори на миокарда MetS

Индуцираната с диета с високо съдържание на мазнини MetS в нашия модел на свинете е свързана с променена миокардна структура, кръвно налягане и миокарден метаболизъм (Фиг. 1). Ние регистрирахме, че хистологичните тъканни участъци на лявата камера, получени от четири свине на хиперкалорична, хиперхолестеролемична диета, показват наличие на повишено отлагане на колаген (Фиг. 1А, n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001) и натрупване на вътреклетъчни липидни тела (Фиг. 1B; n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001) заедно със значително по-ниско отлагане на гликоген (Фигура 1C; n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,001) в сравнение със свинете на контролна постна диета ( LD). Както е показано на Фигура 1D (n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0.001), свинете MetS имат значително повишено систолично и диастолично кръвно налягане и наддаване на тегло след диета (Фигура 1E; n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001) в сравнение с LD животните. Животните от групата на MetS развиха ключови компоненти на метаболитния синдром, включително повишена дислипидемия (Фиг. 1F, n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001), LDL в плазмата (Фигура 1G, n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001) и плазмена глюкоза на гладно (Фигура 1Н, n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001).

MetS и LD свинете се сравняват хистологично чрез използване на вградена в парафин или криоконсервирана миокардна тъкан на лявата камера. Данните са представени като средни стойности ± SD (n = 4 MetS, n = 4 LD). Представителни изображения на миокардната тъкан са показани в x20 поле с висока мощност, ** p Фиг. 2. Метаболомичните сигнатури на миокардния отговор на диетата се получават чрез NMF.

LC/MS-MS се прилага за индивидуално идентифициране и измерване на полярни метаболити (280 полярни метаболити) в сърдечна тъкан на лявата камера от интактни мъжки свине в Йоркшир (MetS n = 6, LD n = 6). (A) Въз основа на LC/MS-MS, получени 12 набора от данни за свине от 280 полярни метаболити, NMF извлича подписи на метаболитни процеси, които ясно отлагат в MetS срещу LD. Идентичността на отделните прасета е показана под лентите. Подписите P1, P2, P3 и P4 са показани на цвят под лентите. (Б) Клъстерна дендрограма, генерирана от ненаблюдавано йерархично клъстериране въз основа на приноса на четирите подписа, идентифицирани от NMF, в базата данни за метаболомиката на 12 свине (коефициент на кофенетична корелация 0,92) (C) Прекалено представените известни пътища в сигнатурата P2 (LD) спрямо MetS (P4) са определени в MetaboAnalyst 4.0. Стойностите им p са показани с цветната диаграма вдясно.

Като цяло, сравнението на двата сигнатура предполага гликолиза, мастни киселини, HBP (биосинтетичен път на хексозамин), дисбаланс на гликогенолиза в MetS.

Състав на метаболитите на P2 и P4.

RNA-seq се прилага за оценка на относителните промени в нивата на mRNA на ензимите в MetS и LD тъканите на миокарда. Графиките показват нива на иРНК в MetS (зелени бъчви) спрямо LD (лилаво) на четири отделни свине MetS и четири LD свине; PGAM1 (p = 6,2x10 -2), ENO1 (p = 2,7x10 -4), GAPDH (p = 0,97); PGM3 (p = 8,5x10 -3), UAP1 (p = 6x10 -1), FASN (p = 0,01); ACAT2 (p = 0,09), ACLY (p = 0,6), CPT1A (p = 2,5x10 -7), HMGCL (p = 0,04), OXCT1 (p = 4,8x10 -8), BDH1 (2,4x10 -12), PYGM (p = 1,4x10 -6), PHKA1 (p = 2,8x10 -8), PHKA2 (p = 0,08) и GYG1 (p = 1,4x10 -7). Данните са представени като средни стойности ± SD (нормализиран брой LD = 4, MetS = 4; p 70%, p Фиг. 5. Сърдечен протеин O-GlcNAcylation в условия на MetS и LD.

LD и MetS сърдечните тъкани се различават по съдържание на O-GlcNAcylated протеини. (A) Парафиновите вградени тъканни секции бяха оцветени с анти-O-GlcNAcylated антитяло (червено) и гладкомускулен алфа актин (зелено). ДНК се оцветява с DAPI (синьо). Идентичността на секциите на тъканите (LD-постно диетичен контрол, MetS-животни, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, и MetS + Ab конкурентни секции на свине MetS след приложение на антитяло N-ацетилглюкозамин) е показана отгоре. Лентите показват средната стойност на представителните независими тъканни участъци от MetS и LD (n = 6 на група) и MetS, които са получили конкурент на антитела (cAb). (B) Western blot с тъканни лизати (50 μg протеин/лента) от три представителни LD прасета (линии 1, 2, 3) и три MetS прасета (линии 5, 6, 7); линия 4 показва лизат след приложение на 5 μg N-ацетилглюкозамин като конкурент. Графчетата вдясно представят средните относителни стойности на специфични сигнали за антитела. Данните са представени като средни стойности ± SD; *** p Фиг. 6. Съдържание на OGT и OGA в сърдечните тъкани на LD и MetS.

(A) Имунофлуоресценция, показваща разлики в съдържанието на OGA (червено) в LD и MetS тъкан, докато съдържанието им на OGT (червено) е почти идентично: зелено показва алфа актинови антитела на гладката мускулатура, а синьо показва ядрената ДНК. Интензивността на червеното оцветяване в повърхност с равен брой ядра беше измерена с NIH ImageJ 1.31 и стълбовата диаграма вдясно представя средната стойност на OGT и OGA оцветяване на тъканни секции от свине MetS, представени като относителни пиксели (n = 4, *** p 6 сдвоени четения/проба, с обхват 43x10 6 -139x10 6 в GENEWIZ (South Plainfield, NJ). Отчитанията са картографирани в свинския референтен геном (USMARCv1.0) с помощта на STAR подравнител [26 ], и количествено отчетено отчитане за всички гени, анотирани (USMARCv1.0) с HTSeq- брой, версия 0.5.3p9 [27]. Анализът на диференциална генна експресия беше извършен в GENEWIZ с пакета за биопроводител DESeq. Изборът на животинска проба за РНК- sq е случаен.

Двумерна тънкослойна хроматография (TLC)

TLC се провежда с извлечените полярни метаболити върху силикагел G плаки с флуоресцентен индикатор при 254 nm (Sigma-Aldrich). Разделянето от първо измерение беше проведено в система с кисели разтворители (етанол - 5N NH4OH-H2O) съотношение 200: 9: 40; второ измерение в система с основен разтворител (нахално формиат-мравчена киселина-вода) съотношение 110: 20: 5. Петна се идентифицират в UV светлина само при миграцията на стандартната молекула.

Периодично киселинно-шифово (PAS), липидно маслено червено оцветяване, Picrosirius червено оцветяване

Оцветяването с периодична киселина-Шиф (PAS) се извършва със системата за оцветяване PAS от Sigma-Aldrich (процедура 395). В сърдечната тъкан оцветяването се дължи главно на реакция с гликоген, въпреки че други въглехидрати с 6 макромолекули също могат да реагират. Комплект за оцветяване на липиди (маслено червено O) (Bio Vision, Каталожен № K580-24) е използван за оцветяване за натрупване на липиди. Червено оцветяване Picrosirius беше проведено с комплект от Polysciences, Inc. Четири диапозитива на животно са използвани за количествено определяне на данните; бяха заснети четири изображения от произволна област на слайд и средното положително оцветяване беше определено с помощта на софтуера Image J.

Полярни метаболити LC/MS-MS

Полярните метаболити се екстрахират от 100 mg замразена светкавица с 1 ml ледено студен 80% (v/v) метанол и 0,6 ml ацетонитрил и се анализират с помощта на 5500 QTRAP хибриден троен квадруполен масспектрометър (AB/SCIEX), свързан към Prominence UFLC HPLC система (Shimadzu) със SRM, както е в [8]. Пикови области от общия йонен ток за всеки преход на SRM на метаболит бяха интегрирани с помощта на софтуера MultiQuant v2.0 (AB/SCIEX). LC/MS-MS беше проведена за отделните проби от прасета (12 прасета в 12 независими опити). MetaboAnalyst 4.0 е използван за идентифициране на известни пътища за участие.

Неотрицателна матрична факторизация (NMF)

Приложена е неотрицателна матрична факторизация (NMF), както е показано в [10] за търсене на метаболитни сигнатури в LC/MS-MS набора от данни за 280 метаболити в анализираните йоркширски прасета (MetS n = 6, LD n = 6) общо 12 прасета . Йерархичното групиране беше извършено както в [26, 28]. Всички симулации се изпълняват на Linux клъстери в Националната лаборатория в Лос Аламос.