Оригинална статия

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Цитати
  • Метрика
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

Резюме

Контекст: Необходимо е откриването на нови природни средства за предотвратяване и лечение на метаболитни нарушения като хипергликемия, неинсулинозависим захарен диабет тип II и затлъстяване. Няколко Ахилея видове се използват от векове по целия свят и обикновено се считат за ефективни като хипогликемични.

инхибиторни

Обективен: Отчитайки етноботаничните употреби на Ахилея род, ние оценихме инвитро инхибиторна активност на Achillea tenorii Екстракт от Grande (Asteraceae) върху α-глюкозидаза, която е ценна цел за предотвратяване и лечение на метаболитни нарушения. Тествахме и антиоксидантната му активност. Нещо повече, фитохимичният профил беше обсъден от хемотаксономична гледна точка.

Материали и методи: Инвитро беше анализирано инхибирането на α-глюкозидазата на суров етанолов екстракт, получен от надземните части, както и инвитро измервана е антиоксидантната активност (ABTS, DPPH и FRAP-FZ тестове). Екстрактът се характеризира от фитохимична гледна точка посредством спектроскопски анализ.

Резултати: Резултатът от екстракта е снабден с инхибиторна активност на α-глюкозидаза (IC50 32 µg/mL) със специфичен механизъм на действие, който може да се определи като неконкурентен, който се различава от механизма, наблюдаван за най-известния инхибитор на α-глюкозидазата (акарбоза и миглитол) . Освен това е установен значителен антиоксидантен потенциал за А. тенории екстракт, в резултат на което се състоят главно фенолни съединения като кофеилхининови киселини и флавоноиди.

Дискусия и заключения: Тези резултати предполагат потенциала на А. тенории като възможно природно средство за предотвратяване и лечение на метаболитни нарушения на въглехидратите.

Въведение

Обективен

В тази работа ние изяснихме фитохимичния състав на А. тенории полярна фракция, обсъждайки резултатите от хемотаксономична гледна точка. Освен това, за да се предостави информация за потенциала на А. тенории хидроалкохолен екстракт като антиоксидант, проведохме тестове ABTS, DPPH и FRAP-FZ. Освен това, като се има предвид етноботаничното използване на различни Ахилея видове при лечението на диабет, както и различни проучвания за хипогликемичния ефект на тези растения (Al-Hindawi et al., 1989; Yazdanparast et al., 2007), ние тествахме инхибиторната активност на А. тенории екстракт от α-глюкозидаза, свързан с мембраната ензим от семейството GH31, който играе ключова роля за усвояването на въглехидратите. Всъщност този ензим катализира последната стъпка в процеса на храносмилане на въглехидратите, чрез хидролиза на полизахариди в глюкоза и сродни монозахариди, които могат лесно да се усвоят (El-Kaissi & Sherbeeni, 2011) Следователно, този ензим може да се счита за ценна цел, за да се намали покачването на кръвната глюкоза след хранене, а инхибиторите на а-глюкозидаза могат да бъдат полезни за предотвратяване и лечение на метаболитни нарушения като неинсулинозависим захарен диабет тип II, затлъстяване и хипергликемия ( Барон, 1998; Тейлър и Джонсън, 1996).

Материали и методи

Общ

ЯМР спектрите са записани на Varian Mercury 300 MHz инструмент, използвайки CD3OD или D2O като деутерирани разтворители; химичните отмествания са изразени в ppm от тетраметилсилан (TMS).

MS спектрите бяха извършени на Q-TOF MICRO спектрометър (Waters, Manchester, UK), оборудван с ESI източник, който работеше в отрицателен и/или положителен йон режим. Скоростта на вливане на пробата е 10 μL/min със 100 придобивания на спектър. Данните бяха анализирани с помощта на софтуера MassLynx, разработен от Waters (Манчестър, Великобритания).

Разтворители от клас RPE са закупени от Sigma Aldrich (Милано, Италия) или Carlo Erba Reagenti (Милано, Италия); силикагел 60 (70–230 меша ASTM) бяха от Fluka (Дрезден, Германия); всички останали реактиви са закупени от Sigma Aldrich (Милано, Италия).

Растителни материали

Растителните материали бяха събрани от националния парк Majella на юни 2011 г. и ботаническата идентификация беше извършена от ботаниците на парка (д-р Mirella Di Cecco и д-р Giampiero Ciaschetti). Проба от изследваното растение се съхранява в нашата лаборатория под номера за присъединяване: AT03062011.

Екстракция и изолиране на полярни съединения

Бяха проведени четири последователни екстракции А. тенории надземни части (400 g), като се използва смес етанол/вода (3 L за всяка екстракция, 48 h време за инфузия). По-специално, за първата екстракция се използва етанол 96% v/v, докато при следващите три екстракции се използва етанол 80% v/v. Получените екстракти се събират отделно и след изпаряване на органичния разтворител екстрактите се замразяват и лиофилизират. От първата до четвъртата екстракция: 10.12, 1.87, 1.52 и 0.89 g сурови екстракти са получени.

Хроматографският скрининг на TLC разкрива изобилието от фенолни съединения, което също се доказва от силна положителна реакция с реагента за пръскане FeCl3. Четирите екстракта изглеждаха сходни от качествена гледна точка, докато количествените разлики бяха очевидни, по-специално третият и четвъртият екстракт бяха съставени главно от съединения с Rе. d -глюкопиранозид (6) (17,3 mg) и лутеолин-7-О-β- d -глюкопиранозид (7) (29,1 mg) от по-полярните фракции и съответните флавонови агликони апигенин (4) (8,2 mg), лутеолин (5) (5,6 mg) от по-малко полярните фракции (Фигура 1). Всички изолирани вещества бяха идентифицирани чрез сравняване на експериментални спектроскопски данни с тези, докладвани в литературата, а също и чрез директно сравнение със стандартните вещества, налични в нашата лаборатория.

Публикувано онлайн:

Фигура 1. Идентифицирани съединения с полярна фракция.

Фигура 1. Идентифицирани съединения с полярна фракция.

3-О-Кофеоилхинова киселина (хлорогенова киселина) (1): 1 H NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7,55 (1Н, d, J = 15,9 Hz, Hp), 7,04 (1H, d, J = 1,9 Hz, H2 '), 6,95 (1H, dd, J = 8,2, 1,9 Hz, H6 '), 6,77 (1H, d, J = 8,2 Hz, H5 '), 6,26 (1H, d, J = 15,9 Hz, Ha), 5,33 (1H, td, J = 9,1, 4,5 Hz, H3), 4,22–4,12 (1H, m, H4), 3,72 (1H, dd, J = 8,5, 3,1 Hz, H5), 2,29–1,97 (4H, м, Н2, Н6). 13C NMR 75 MHz, D20, δ: 179,7 (COOH quin.), 168,9 (COO caff.), 147,5 (C4 ′), 146,1 (Cβ), 144,2 (C3 ′), 129,7 (C1 ′), 122,6 (C6 ′), 116,2 (C5 ′), 115.3 (C2 '), 114.2 (Cα), 77.1 (C1), 75.9 (C3), 74.3 (C4), 72.9 (C5), 38.9 (C6), 37.0 (C2). ESI-MS: m/z [М + Na] + = 377.02; m/z [М - Н] - = 352,85.

5-О-Кофеоилхинова киселина (неохлорогенова киселина) (2): 1H NMR 300 MHz D2O δ: 7,31 (1Н, d, J = 15,9 Hz, Hp), 6,76 (1H, d, J = 1,8 Hz, H2 '); 6,64 (1Н, d, J = 1,8 Hz, H6 '); 6,06 (1Н, d, J = 15,9 Hz, Ha); 5,05 (1Н, с, Н5); 4,08 (1Н, bd, НЗ); 3,81 (1Н, bd, Н4); 2,00 (1Н, м, Н6); 1,886 (1H, м, Н2). 13C NMR 75 MHz, D20 δ: 180.8 (COOH quin.), 169.8 (COO caff.), 147.9 (C4 ′), 146.9 (Cβ), 145.09 (C3 ′), 127.8 (C1 ′), 123.5 (C6 ′), 117.05 (C5 ′), 115,96 (C2 '), 115,4 (Cα), 77,59 (C1), 73,73 (C4), 72,49 (C5), 71,9 (C3), 38,9 (C6), 37,9 (C2). ESI-MS: m/z [М + Na] + = 377.02; m/z [М - Н] - = 352,85.

Кофеинова киселина (3): 1 H NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7,54 (1Н, d, J = 15,9 Hz, Hp), 7,04 (1H, d, J = 1,9 Hz, H2), 6,93 (1H, dd, J = 8,2; 1,9 Hz, H6), 6,78 (1H, d, J = 8,2 Hz, H5), 6,22 (1H, d, J = 15,9 Hz, Hα). 13 C NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 171,08 (COOH), 149,36 (Cp), 147,06 (C4), 146,69 (C3), 127,72 (C1), 122,87 (C6), 116,44 (C5), 115,42 (C2), 115,05 (Cα). ESI-MS: m/z 179,05 [M - H] - .

Апигенин (4): 1 H NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7,84 (2Н, d, J = 8,6 Hz, H2 ', H6'), 7,12 (2H, d, J = 8,5 Hz, H3 ', H5'), 6,82 (1H, с, НЗ), 6.68 (1Н, d, J = 2,0 Hz, H8), 6,57 (1H, d J = 2,0 Hz, H6). 13C NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 182.0 (C4), 165.7 (C7), 163.2 (C5), 162.5 (C2), 162.2 (C4 '), 157.6 (C9), 129.1 (C2', C6 '), 122.0 (C1 '), 116.8 (C3', C5 '), 105.3 (C10), 103.3 (C3), 99.0 (C6), 94.6 (C8). ESI-MS: m/z 269,03 [M - H] - .

Лутеолин (5): 1 H NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7.41 (1Н, dd, J = 8; 2 Hz, H6 '), 7,37 (1H, d, J = 2 Hz, H6 '), 6,90 (1H, d, J = 8,2 Hz, H5 '), 6,68 (1H, с, НЗ), 6.47 (1Н, d, J = 1,8 Hz, H8), 6,28 (1H, d, J = 1,8 Hz, H6). 13 C NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 182.4 (C4), 164.7 (C7), 164.4 (C2), 162.5 (C5), 150.4 (C4 ′), 146.6 (C3 ′), 123.1 (C6 ′), 119.5 (C1 ′), 116.8 (C5 ′), 104,7 (С10), 99,6 (С6), 96,2 (С8). ESI-MS: m/z 287,15 [М - Н] -; m/z 309,27 [М + Na] + .

Апигенин-7-О-β- d -глюкопиранозид (козметин) (6): 1 H NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7,85 (2Н, d, J = 8,5 Hz, H3 ', H5'), 6,92 (2H, d, J = 8,6 Hz, H2 ', H6'), 6,79 (1H, с, Н8), 6,62 (1Н, с, НЗ), 6.48 (1Н, с, Н6), 5.07 (1Н, d, J = 7,0 Hz, H1 ″), 4,12–3,50 (сигнали за припокриване на захар). 13 C NMR (75 MHz, CD3OD) δ 184,0 (C4), 166,7 (C7), 164,7 (C5), 163,8 (C2), 162,8 (C4 ′), 158,9 (C9), 129,6 (C2 ′, C6 ′), 123,0 (C1 ′), 117,0 (C3 ′), C5 ′), 107.0 (C10), 105.3 (C3), 104.1 (C6), 101.6 (C1 ″), 78.5 (C5 ″), 77.3 (C3 ″), 74.7 (C2 ″), 71.3 (C4 ″), 62,5 (С6). ESI-MS: m/z 431,26 [M - H] - .

Лутеолин-7-О-β- d -глюкопиранозид (цинарозид) (7): 1 H NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7.42 (2Н, bd, J = 8,2, Н6 ', Н2'), 6,89 (1Н, d, J = 8,5, Н5 '), 6,79 (1Н, bs, Н8), 6,68 (1Н, bs, НЗ), 6.47 (1Н, с, Н6), 5.09 (1Н, d, J = 7,2, H1 ″). 13 C NMR (75 MHz, CD3OD) δ 184,2 (C4), 166,7 (C7), 164,8 (C2), 162,8 (C5), 151,0 (C4 ′), 147,1 (C3 ′), 124,1 (C6 ′), 120,5 (C1 ′), 117,1 (C5 ′), 104,2 (C10), 101,2 (C1 ″), 99,5 (C6), 96,1 (C8), 77,9 (C5 ″), 75,4 (C3 ″), 74,7 (C2 ″), 72,9 (C4 ″), 62,51 (C6 ″) . ESI-MS: m/z 471,14 [М + Na] +; m/z 447,23 [М - Н] - .

Биологични дейности

DPPH и ABTS

Анализът на DPPH се извършва съгласно Brand-Williams et al. (1995), с някои модификации. Различни изходни разтвори на растителен екстракт се приготвят в етанол/вода (20% v/v), за да имат различни крайни концентрации (5, 10, 30, 50 и 100 µg/mL в анализа), за да се изчисли стойността на IC50. Разтворът на метанол DPPH се добавя към различни концентрации на екстракта и се оставя да реагира при стайна температура. Анализът се извършва в краен обем от 2,0 ml. След 20 минути стойностите на абсорбция (Abs) се измерват при 517 nm и се превръщат в процентна антиоксидантна активност, като се използва следната формула:

Като отрицателна контрола се използва само разтвор на DPPH плюс метанол, като положителен контрол се използва Trolox (Tr) при различни концентрации (от 5 до 50 µM), а Tr се използва за изчисляване на общия антиоксидантен капацитет (TAC), изразен в mmol Tr екв./G екстракт.

ABTS анализът се извършва съгласно Arnao et al. (2001), с някои модификации. ABTS • + радикалът се генерира чрез смесване на 2.0 mM ABTS разтвор със 7.0 mM K2S2O8 и инкубиране на тъмно в продължение на 24 часа при стайна температура. Преди употреба разтворът ABTS • + се разрежда (1–25 ml метанол), за да се получи Abs от 0,7 при 734 nm. 0.9 ml от разреден ABTS • + разтвор към 10 µL Tr (положителен контрол) или екстракт от изходни разтвори бяха добавени, за да имат крайни концентрации 5, 10, 15, 20, 50 и 100 µg/ml. Абс при 734 nm се записва след 1,0 минути. Стойностите на IC50 както в ABTS, така и в DPPH са изчислени чрез линейна регресия на графики, където х-оста представлява проба или концентрации на Tr, и у-оста представлява средния процент на капацитета за почистване от три независими експеримента с дублирани проби.

FRAP-феррозинов анализ

Колориметричният метод е използван за определяне на способността на екстракта да намалява железните йони (Fe 3+) в железни йони (Fe 2+), който е получен по метода, предложен от Beker et al. (2010) с някои модификации.

Създадена е калибрационна крива за комплекса Fe 2+/ферозин (FZ), като се използват нарастващи концентрации на FeCl2 (от 0 до 100 µM) и 0,5 mM FZ (в дестилирана вода) в краен обем от 1 ml. 200 µL от предварително приготвена смес, съдържаща FeCI3 (1 mM) и FZ (5 mM), бяха добавени към 100 µL Tr (концентрациите варират от 6.0 до 300 µM) или екстракт (концентрациите варират от 10 до 50 µg/ml). Abs се отчита в четеца на микроплаки при 570 nm след 5 минути инкубация при стайна температура. Abs на сместа FeCl3/FZ се изважда от тази, получена с Tr или проби. За да се изгради крива доза-отговор за Tr, количеството Fe 2+, произведено от различни концентрации на този антиоксидант, се изчислява от калибрационната крива.

Въз основа на кривата доза-отговор се изчислява FRAP единица, която представлява количеството на пробата, способно да произвежда 100 µM Fe 2+. Стойността на TAC (mmol Tr/g екстракт) се изчислява, сравнявайки резултата, получен от екстракта, с този на Tr. Анализът се извършва в два екземпляра и се повтаря три пъти.

Анализ на инхибитор на α-глюкозидаза

α-Глюкозидаза от Saccharomyces cerevisiae (E.C. 3.2.1.20) е закупен от Sigma Aldrich Co (Сейнт Луис, Мисури) и е извършен анализ за инхибиране на α-глюкозидаза съгласно Li et al. (2005) с леки модификации. 3 mU ензим (една единица ще освободи 1,0 µmol d -глюкоза от стр-нитрофенил-α- d -глюкопиранозид на минута при рН 6,8 при 37 ° С), приготвен в 0,1 М фосфатен буфер, рН 6,8 се инкубира в продължение на 10 минути с тестови проби при различни концентрации: от 5 до 100 µg/ml или чисти стандартни съединения (лутеолин, хлорогенова киселина) от 0,01 до 1,5 mM, до краен обем от 100 µL. Синтетичният субстрат стр-нитрофенил-a- d -глюкопиранозид (p-NPG), приготвен в буфер, се добавя към предварително инкубираната смес с крайна концентрация 2 тМ, за да започне реакцията с краен обем от 200 uL. След 5 минути (т5), се добавят 50 uL NaOH 0,1 М и абсорбцията при 405 nm се записва в четеца на микроплаки при постоянна температура от 30 ° С. Първоначалната абсорбция на пробите при т0 се установява чрез техните заготовки (съдържащи всички реагенти с изключение на ензима). Специфичната активност на посочения ензим стр-NPG е 14 U/mg, както е съобщено от купувача.

Стойността на IC50 (концентрация, необходима за 50% инхибиране) се изчислява чрез изграждане на логаритмична крива, показваща концентрациите на пробите върху х-оси и процентното инхибиране на у-брадви. Процентът на инхибиране на ензимната активност се изчислява по следната формула:

Получена е отрицателна контрола чрез добавяне на вода вместо проби и стойностите на ΔAbs са изчислени като Abs т10 - Абс т0 и се отнася за 1 мин.

Графикът Lineweaver – Burk (L – B) е конструиран, за да се изчислят кинетичните параметри (Кm, изразено в mM и vmax в nkat) на ензимната реакция със и без проби при концентрации IC50. Различен стр-Концентрациите на NPG бяха използвани в диапазона 2–0,25 mM; скоростта на ензимната реакция, изразена в µkat, се изчислява от ΔAbs min, като се има предвид p-нитрофенолат ϵ при 405 nm = 18,5 mM −1 cm −1 и дължина на пътя на светлината = 0,8 cm.

Статистически анализ