Jinrong Zeng 1 *, Li Lei 1 *, Qinghai Zeng 1, Yuying Yao 2, Yuqing Wu 2, Qinxuan Li 2, Lihua Gao 1, Hongjiao Du 1, Yajie Xie 1, Jinhua Huang 1, Wenbin Tan 3,4, Jianyun Lu 1

терапия

1. Департамент по дерматология, Трета болница Xiangya, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай;
2. Медицинско училище XiangYa, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай;
3. Катедра по клетъчна биология и анатомия, Медицински факултет, и
4. Катедра по биомедицинско инженерство, Колеж по инженерство и изчисления, Университет на Южна Каролина, Колумбия, Южна Каролина
* Тези автори са допринесли еднакво за тази работа.

Цитат:
Zeng J, Lei L, Zeng Q, Yao Y, Wu Y, Li Q, Gao L, Du H, Xie Y, Huang J, Tan W, Lu J. Озоновата терапия намалява NF-κB-медиирания локален възпалителен отговор и активирането на Th17 клетки в лечение на псориазис. Int J Biol Sci 2020; 16 (11): 1833-1845. doi: 10.7150/ijbs.41940. Достъпно от https://www.ijbs.com/v16p1833.htm

Ключови думи: озонотерапия, NF-κB, TLR2, Th17, псориазис

За първи път озонът се прилага клинично като стерилизиращо средство поради силното си окислително свойство. Той е широко използван за лечение на повече от 50 различни патологични състояния, включително инфекциозни кожни заболявания [15-18], алергични заболявания [19, 20], еритемни люспести заболявания [21, 22], зарастване на рани и възстановяване на язва [23] . Механизмите на действие на озона могат да бъдат в основата на антимикробните ефекти, имунорегулацията, антиоксидантната защита, епигенетичната модификация, биосинтеза, аналгетиците и вазодилатацията [24]. Настоящите озонови медицински препарати за дерматология попадат в следните основни класификации: озонова хидротерапия, локално озонирано масло, озонова автохемотерапия (OAHT) и озонова газова кухина/акупунктурна инжекция [24]. Последните проучвания показват, че прецизният контрол на концентрациите на озон може да предизвика производството на различни цитокини, като IFN-γ, IL-6 и TNF-α [25]. Озонът може да индуцира и активира антиоксидантната ензимна система на организма, за да произвежда средства за почистване на свободните радикали, да премахва някои от свободните радикали, генерирани от възпалителни реакции, и да пречи на производството на възпалителни фактори по време на развитието на заболяването [26]. Точните механизми на озоновата терапия при лечение на заболявания обаче трябва да бъдат допълнително изяснени.

В това проучване ние оценихме терапевтичната ефикасност на краткосрочното лечение с озон за псориатични пациенти. Изследвахме потенциалните механизми на локалната озонотерапия за псориазис, използвайки имиквимод (IMQ) индуциран псориазис-подобен модел на мишка. Установихме, че озоновата терапия отслабва възпалителните реакции при псориазис чрез инхибиране на NF-κB пътя. Нашите резултати показват, че озоновата терапия е безопасно и ефективно лечение на псориазис и заслужава по-нататъшни клинични оценки и приложения.

Пациенти

Това проучване беше одобрено от институционалния съвет за преглед (IRB) на Трета болница Xiangya, Централен южен университет, Чангша, Хунан, Китай. Общо 10 пациенти с псориазис, диагностицирани с псориазис вулгарис, са били включени в проучването и всички лица са подписали писмени формуляри за съгласие. Клиничната информация за пациентите е показана в Допълнителна таблица 1. Резултатите от PASI са използвани за оценка на активността на заболяването. Критериите за включване в проучването са за пациенти на възраст между 18 и 60 години и с псориазис вулгарис, диагностициран при патологични изследвания. Критериите за изключване включват алергия към озонирана вода или масло; бременност или кърмене; тежки системни заболявания; и получили кортикостероиди, производни на витамин D3, имунни инхибитори, биологична терапия или перорални ретиноиди през последните 2 седмици.

Мишките BALB/c са закупени от Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. На възраст от 6 седмици, женските мишки са били адаптивно хранени в продължение на 1 седмица и използвани за всички експерименти. Всички животни се отглеждат и обработват в центъра за експерименти с животни в Централния южен университет в строго съответствие със съответните закони и институционални насоки. Всички процедури с животни бяха одобрени и контролирани от Комитета по грижа и употреба на животните в медицината към Трета болница Xiangya на Централния южен университет.

Локална озонотерапия

Всички участници бяха лекувани с озониран воден душ (3.0 ± 1.5 mg/L, HZ-2601B, Hunan Health Care Technology, Changsha, China) в продължение на 15 минути, веднъж на ден, след това третирани с локално озонирано масло (20160522, с приблизително пероксидна стойност от 2000-2,400 mmol-еквивалент/kg, Hunan Health Care Technology, Changsha, Китай) два пъти на ден, в продължение на 14 дни.

Оценка на клинични снимки и отражателни конфокални микроскопски изображения на кожни лезии

Всички субекти са получавали само безплатна озонова терапия; те не са получавали никакви други лечения и лекарства по време на изпитанието. Интервенцията продължи 14 дни. Клиничните снимки, PASI резултатите и RCM изображенията бяха оценени от същите професионални лекари, за да се оцени тежестта на заболяването преди и след леченията. Резултатите от PASI включват областта на кожни лезии, еритема, лющене и удебеляване, според литературата [27]. Всеки субект беше оценен чрез RCM изображения от три различни места на кожни лезии. Общата RCM сканирана дебелина на кожата е 51 слоя × 3,05 µm (вертикално) във всеки слой. Под RCM, дебелината на епидермиса и инфилтрираните възпалителни клетки също бяха оценени преди и след лечението.

IMQ-индуциран модел на мишка на псориазис и озонова интервенция

Женски мишки BALB/c (на възраст 6-8 седмици) бяха хранени при подходящи условия. Мишките бяха намазвани ежедневно с 5% IMQ крем (Sichuan Med-Shine Pharmaceutical Co., Ltd., H20030128, Sichuan, China) върху обръснатите си гръбни кожи в продължение на 7 последователни дни. Мишките от контролната група бяха третирани със същото количество от крема на носителя. Всички IMQ мишки бяха разделени на случаен принцип в три групи: неинтервенционната група (IMQ група), групата за третиране на озон (IMQ + озон) и групата за третиране на крема (IMQ + Vehicle). Групата за обработка на озона се третира с озонирана вода (HZ-2601B, Hunan Health Care Technology Co., Ltd., Changsha, China) в продължение на 15 минути веднъж на ден, след което се третира с локално озонирано масло (20160522, Hunan Health Care Technology Co ., Ltd., Чанша, Китай). Групата за третиране на кремове за превозни средства получава вода от чешмата и базово масло със същата честота. Интервенцията продължи 7 дни. Клинични снимки и PASI резултати са събрани, за да се оценят фенотипните характеристики. На 7-ия ден всички мишки бяха жертвани за събиране на кожни лезии, тъкани на далака и лимфни възли.

Изолиране на CD4 + Т клетки

Мононуклеарните клетки от периферна кръв (PBMC) се отделят от периферната кръв на пациентите преди и след лечението чрез центрофугиране, като се използва среда с градиент на плътността (GE Healthcare, Чикаго, IL, САЩ). CD4 + Т клетки бяха изолирани чрез положителна селекция, използвайки мъниста Miltenyi, съгласно инструкциите на производителя (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия). След това изолираните CD4 + Т клетки се събират за последващи експерименти. В експеримента с мишки CD4 + Т клетките се пречистват от обединени едноклетъчни суспензии на далак, като се използва комплект за изолиране на CD4 + Т клетки на мишка от Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Германия).

Поточна цитометрия

Общата РНК се извлича от клетки или кожни тъкани, използвайки TRIzol, съгласно инструкциите на производителя (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). ИРНК се транскрибира обратно с комплекта за реагенти PrimeScript® RT (Takara Biomedical Technology Co., Ltd., Kusatsu, Shiga, Japan) с 1 μg обща РНК във всяка реакция. Реакционната смес за PCR в реално време съдържа 2 μL кДНК, 10 μL SYBR Premix Ex Taq ™ (Takara Biomedical Technology Co., Ltd., Kusatsu, Shiga, Япония) и 400 nM смислени и антисенс праймери за финал обем от 20 μL. QPCR беше извършен на термоциклер LightCycler ® 96 (Roche, Rotkreuz, Швейцария). Количеството генна експресия се изчислява, като се използват 2 -ΔCt методите и се нормализира до глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH). Грундовете са показани в допълнителна таблица 2.

Западно петно

CD4 + Т клетките се лизират и протеините се екстрахират с помощта на реактор за ядрена екстракция (Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA). Количествените белтъци се определят от реактива на Брадфорд (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), последвано от 12% вертикална додецил сулфатно-полиакриламидна гел електрофореза. След това протеините се прехвърлят в мембрана на поливинилиден дифлуорид (PVDF) (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО, САЩ). Мембраната PVDF се блокира в 5% обезмаслено мляко за 1 h при стайна температура, след което се инкубира с антитяло срещу P65 (GB11142, 1: 1000, Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China) или P50 (ab7971, 1: 5000, Abcam, Cambridge, MA, USA) за 12-16 часа при 4 ℃, и последвано от инкубация с миши анти-заешки IgG антитела (H&L) (GenScript, Piscataway, NJ, USA). Протеините бяха открити с усилен хемилуминесцентен (ECL) уестърн блот комплект за откриване (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Количественото определяне на P65 и P50 се нормализира до GAPDH чрез денситометрия.

Хистологичен анализ

Кожните тъкани от всички пациенти и мишки бяха фиксирани във формалин и вградени в парафин (Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, Китай). Секции (6 µm) се оцветяват с хематоксилин и еозин и се съхраняват при стайна температура. Оценени са дебелината на епидермиса и инфилтриращите възпалителни клетки.

Имунохистохимично оцветяване

Секции (6 µm) бяха оцветени с антитела P50 (каталожен № BS1249, Bioworld Technology Co., Ltd., Нанкин, Китай), P65 (каталожен номер 10745-1-AP, Proteintech, Rosemont, IL, САЩ) и TLR2 антитела (каталожен номер ab213676, Abcam, Cambridge, MA, USA) съгласно инструкциите на производителя. Анализът на изображението беше извършен с помощта на флуоресцентен микроскоп и софтуер за анализ Leica Qwin Std (Leica, Wetzlar, Германия).

Последователност с висока производителност

Получени са транскриптомни профили на лявата и дясната страна на кожните лезии от модели за самоконтрол на мишки и лезии от гръбните кожи на мишката в контролната група и IMQ групата. Накратко, от тези кожни проби беше извлечена обща РНК; иРНК беше обогатена, фрагментирана и използвана за синтеза на кДНК. СДНК фрагментите бяха амплифицирани чрез PCR и размерът и качеството на секвенционната библиотека бяха определени с помощта на Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Библиотеката беше секвенирана с помощта на високопроизводителна платформа за секвениране HiSeq X Ten (Illumina Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ). Диференциално експресираните гени сред избраните проби бяха анализирани чрез анализ на обогатяването на пътя на Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

Статистически анализ

Всички диаграми и графики, отчитащи кумулативни данни, са генерирани с помощта на GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Данните са представени като средни стойности ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Разпределението на средствата се анализира с непараметрични тестове (SPSS 18.0, IBM, Armonk, NY, USA). Различията в отделните лечения бяха анализирани по двойки т тестове. Статистическа значимост (*P + Т клетки от периферната кръв на пациентите, използвайки количествена PCR в реално време (qPCR). Очаквано, нивата на експресия на IL-17a, IL-6, TNF-α, трансформиращ растежен фактор (TGF) -β, IFN-γ и NF-kB бяха регулирани надолу след третиране с озон в сравнение с преди лечението (Фигура 1е). Експресионните нива на IL-17f и Th17-клетъчно специфичния транскрипционен фактор, свързан с ретиноиди сирачен ядрен рецептор c (RORc), намаляват след третиране с озон, но намаляването няма статистическа значимост (Фигура 1f). Експресията на IL-10 се увеличава след лечение с озон, но не значително. Тези резултати са в съответствие с клиничната ефикасност. Взети заедно, нашите резултати показват, че локалното лечение с озон може да подобри състоянието на псориатични кожни лезии при пациенти чрез инхибиране на възпалителните процеси.

Локалното лечение с озон значително инхибира индуцираните от IMQ псориазис-подобни лезии в кожата на мишката. Мишките бяха разделени на случаен принцип в четири групи: Ctrl, IMQ, IMQ + Vehicle и IMQ + Ozone. а) Кожните лезии и хистологичните особености сред различните групи на лечение. б) Промени в телесното тегло и (° С) Резултати по PASI за мишки в различни групи за лечение. (д) Съотношението на далака и далака към тялото в различните групи на лечение. Забележка: * = P + Т клетки, изолирани от далаци и лимфни възли на мишка. Уестърн блотинг за оценка на нивата на експресия на P65 (д) и P50 (д) в CD4 + Т клетки, изолирани от далаци на мишки и лимфни възли от четири групи. Относителните нива на експресия бяха нормализирани до нивата на GAPDH. Забележка: * = P

Получено 2020-1-12
Приети 2020-3-21
Публикувано 2020-4-6