Отдел по фармакология на филиала, CSIR-Централен институт за изследвания на лекарствата, B.S. 10/1, сектор 10, разширение Jankipuram, Лакнау, Утар Прадеш, Индия

диета

Отдел по фармакология на филиала, CSIR-Централен институт за изследвания на лекарствата, B.S. 10/1, сектор 10, разширение Jankipuram, Лакнау, Утар Прадеш, Индия

Отдел по фармакология на филиала, CSIR-Централен институт за изследвания на лекарствата, B.S. 10/1, сектор 10, разширение Jankipuram, Лакнау, Утар Прадеш, Индия

Отдел по фармакология на филиала, CSIR-Централен институт за изследвания на лекарствата, B.S. 10/1, сектор 10, разширение Jankipuram, Лакнау, Утар Прадеш, Индия

Отдел по фармакология на филиала, CSIR-Централен институт за изследвания на лекарствата, B.S. 10/1, сектор 10, разширение Jankipuram, Лакнау, Утар Прадеш, Индия

Отдел по фармакология на филиала, CSIR-Централен институт за изследвания на лекарствата, B.S. 10/1, сектор 10, разширение Jankipuram, Лакнау, Утар Прадеш, Индия

Отдел по токсикология на филиала, CSIR-Централен институт за изследвания на лекарствата, B.S. 10/1, сектор 10, разширение Jankipuram, Лакнау, Утар Прадеш, Индия

Отдел по фармакология на филиала, CSIR-Централен институт за изследвания на лекарствата, B.S. 10/1, сектор 10, разширение Jankipuram, Лакнау, Утар Прадеш, Индия

  • Вивек Ханна,
  • Manish Jain,
  • Вишал Сингх,
  • Jitendra S. Kanshana,
  • Прем Пракаш,
  • Маной К. Бартвал,
  • Puvvada S. R. Murthy,
  • Мадху Дикшит

Фигури

Резюме

Цитат: Khanna V, Jain M, Singh V, Kanshana JS, Prakash P, Barthwal MK, et al. (2013) Оттеглянето от диета с холестерол води до първоначална нестабилност на плаката и последваща регресия на ускорена атеросклероза на подвздошната артерия при зайци. PLoS ONE 8 (10): e77037. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077037

Редактор: Оливие Кохер, медицинско училище в Харвард, Съединени американски щати

Получено: 5 юни 2013 г .; Прието: 5 септември 2013 г .; Публикувано: 17 октомври 2013 г.

Финансиране: Проучването е подкрепено с финансова безвъзмездна помощ за M.D. от проекта CSIR THUNDER (BSC0102) и проекта CSIR-Network (BSC0103), Индия. Авторите благодарят за присъждането на стипендии за научни изследвания от Съвета за научни и индустриални изследвания (CSIR), Ню Делхи, Индия за VK, VS, JSK, PP и Индийския съвет за медицински изследвания, Ню Делхи, Индия за MJ Финансиращите бяха никаква роля в дизайна на изследването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Материали и методи

Декларация за етика

Експерименталните протоколи върху животни бяха одобрени от Институционалния комитет по етични животни, Съвет за научни и индустриални изследвания - Централен институт за изследване на наркотици (CSIR-CDRI) (№ на одобрение: IAEC/2010/6). Процедурите бяха проведени в строго съответствие с насоките на Комитета за контрол и надзор на експериментите върху животни (CPCSEA), който съответства на международните норми на Индийската национална научна академия (INSA). Всички усилия бяха положени за подобряване на хуманното отношение към животните и минимизиране на страданията.

Експериментален модел на атеросклероза

Експериментален протокол

Мъжките новозеландски бели зайци бяха допълнени с диета ad libitum chow (CD) и атерогенна диета (AD) съответно в продължение на 8 седмици. Животните от нормалната група (n = 7) получават CD за 8 седмици и след това незабавно се умъртвяват. В края на 8-седмичния период на хранене с AD, шестдесет и четири животни бяха разделени на седем групи въз основа на сходни диапазони на хиперхолестеролемия. Изходна група (изходно ниво; n = 10) животни бяха умъртвени веднага след 8 седмици на хранене с AD, докато други групи бяха жертвани след спиране на AD и възобновяване на CD в продължение на 4 седмици (Reg 4 седмица; n = 9), 8 седмици (Reg 8 седмица; n = 9), 16 седмици (Reg 16 седмица; n = 10), 32 седмици (Reg 32 седмица; n = 8), 50 седмици (Reg 50 седмица; n = 9) и 64 седмици (Reg 64 седмица; n = 9) съответно (Фигура 1).

Шестдесет и четири мъжки новозеландски бели зайци бяха хранени с атерогенна диета (AD) в продължение на 8 седмици, за да създадат атерома. Седем животни са хранени с чау диета (CD) в продължение на 8 седмици. Балонно увреждане на илиачната артерия чрез катетър за емболектомия на Fogarty е извършено 1 седмица след започване на атерогенна диета. Изходната група е определена на 8 седмици атерогенно диетично хранене, последвано от чау диета (CD) от 4 седмици до 64 седмици в съответните групи. n = брой животни

Плазмен липиден анализ

Кръвта беше изтеглена от централната ушна артерия в епруветка, съдържаща 3,8% три-натриев цитрат. Пълна кръв се центрофугира при 4000 g в продължение на 10 минути при 4 ° С, за да се получи плазма. Общият холестерол (TC), триглицеридите (TG), липопротеиновият холестерол с висока плътност (HDL-C) и липопротеиновият холестерол с ниска плътност (LDL-C) са оценени с помощта на автоматизиран анализатор (Beckman Coulter Inc., САЩ) с помощта на търговски комплекти [20].

Хистология

При прекратяване частта от илиачната артерия близо до аорта-илиачната бифуркация се изолира и се съхранява в 10% буфериран разтвор на формалин в продължение на 24 часа. Една проксимална част на артерията е замразена в OCT съединение за секциониране на криостат, а друга част е обработена за вграждане на парафин. Артериите от всички групи са били подложени на едновременни и подобни процедури за фиксиране, дехидратация и инфилтрация с восък, за да анулират промените в размерите, предизвикани от обработки с разтворител. Серийни парафинови срезове (5 µm) бяха събрани през цялата артериална дължина за оцветяване. За обща архитектура на плака, оцветяване с хематоксилин и еозин (HE) и за клетъчни компоненти Movat Pentachrome оцветяване, при което мускулите са оцветени като червени, фибриноидните тъканипоказва като интензивно червено, муцин/смляно вещество е оцветено в синьо до синьо зелено, черният цвят отразява ядрата и еластичен влакна и жълт цвят изобразява колаген и ретикуларни влакна [21]. Червеното оцветяване Picrosirius се използва за идентифициране на типа колагенови влакна (тип I: жълто/оранжево и тип III: зелено, под поляризирана светлина). Секциите бяха снимани с еднакво време на експозиция за всяка секция [22], [23]. Лезиите на лезиите се визуализират върху замразени секции, като се използва маслено червено О оцветяване.

Морфометричен анализ

Имунохистохимия

Вградените в парафин последователни секции се оцветяват със следните антитела: Миши моноклонални анти заешки CD68 (RAM11, Dako, САЩ), алфа гладкомускулен актин (1A4, Sigma, САЩ) и MMP-9 (56-2A4, Calbiochem, САЩ). Имунореактивността беше разкрита с помощта на Novacastra Novolink Polymer система за откриване (Leica Microsystems, САЩ) и оцветена с хематоксилин. За всички антитела е използван подходящ положителен контрол. Отрицателните контроли включват пропускане на първичното антитяло и използване на неимунен миши IgG (Santa Cruz Biotechnology, САЩ) или само на вторично антитяло. Във всички случаи отрицателните контроли показват незначително оцветяване.

Оценка на ендотелната функция

Сегментите на илиачната артерия с дължина 4 mm бяха монтирани в 10 ml вана за органи, съдържаща разтвор на Krebs, поддържана при 37 ° C и непрекъснато оксидирана с 95% O2–5% CO2. Тъканта беше поддържана под постоянно напрежение от 2 g през целия експеримент и беше уравновесена чрез периодична промяна на буфера на Kreb в продължение на 90 минути [29]. Записани са изометрични измервания със силови преобразуватели (FSG-01, Будапеща, Унгария) с помощта на S.P.E.L. пакет от решения за експериментални лаборатории ADVANCE ISOSYS софтуер за събиране и анализ на данни. Сегментите на подвздошната артерия бяха предварително свити с допълнителни дози фенилефрин (РЕ) (1 nM – 100 µM). Степента на вазоконстрикция се изразява като грамово напрежение. След предварително свиване до 50% от максималния отговор на фенилефрин, пръстените бяха изложени на нарастващи дози ацетилхолин и бяха генерирани криви на релаксация в отговор на ацетилхолин (Ach) (3 nM до 3 mM) [30], [31]. Степента на вазорелаксация се изразява като грамово напрежение върху предварително контрактираните пръстени на фенилефрин [29], [32].

RT-PCR в реално време

Количественият анализ на генната експресия беше извършен с помощта на технологията SYBR Green. Общата РНК беше извлечена от прясно изолирана ранена илиачна артерия от различни групи, като се използва TRIZOL процедура за изолиране, както е описано по-горе [33] и cDNA беше синтезирана с помощта на RevertAid ™ H Minus комплект за синтезиране на първа нишка cDNA съгласно протокола на производителя (Invitrogen, САЩ). Експресията на mRNA на ключови гени, участващи в атеросклерозата, беше количествено определена, използвайки специфични праймери (Таблица S1). RT-PCR в реално време се извършва в PCR система LightCycler® 480II в реално време от приложната наука на Roche (Индианаполис, САЩ). Условията за амплификация бяха използвани в това проучване, състоящо се от първоначална предварителна инкубация при 94 ° C или 95 ° C в продължение на 10 минути, последвана от амплификация на целевата ДНК в продължение на 45 цикъла [95 ° C за 10 s и 54–60 ° C (както приложимо) за 10 s]. Анализът на кривата на топене се извършва веднага след усилване, използвайки протокола на производителя. Относителната експресия на иРНК беше изчислена чрез използване на метод за сравнителен цикъл на прага (2− ΔΔ Ct), използвайки GAPDH като вътрешен стандарт [34].

Статистически анализ

Резултатите са изчислени като средна стойност ± SEM. Статистическата значимост на разликата между различните групи се определя по един начин ANOVA, последван от post-hoc тест на Dunett, използващ софтуера GraphPad Prism 5. Стойността на Р 0,05 или по-малко е избрана за статистическа значимост.

Резултати

Нива на липидите в кръвта

Изходната група показва значително увеличение на TC, TG, LDL-C и HDL-C (p Таблица 1. Липиден профил и хистологични измервания на илиачната артерия в различни експериментални групи.

Оттеглянето на холестерола води до първоначално увеличение, последвано от прогресивно намаляване на съотношението на дебелината на интима-медиума (IMT), площта на плаката, лезията на липидите и съдържанието на пяна от макрофаги

Артериите в нормална група, невредими артерии и Reg 64 седмична група не показват удебеляване на интимата (данните не са показани) без честота на образуване на пяна. В изходната група атеросклеротичната лезия показва значително увеличаване на артериалното IMT съотношение, площта на плаката и% CSN (p Фигура 2. Фазата на регресия води до прогресивно намаляване на процентното съдържание на липиди и съдържание на макрофаги от пяна.

Панел (А) Представителни изображения на оцветени с хематоксилин и еозин участъци от всички групи (скала = 500 µm). Панел (B) Представителни изображения на оцветени в маслено червено O криостатични секции от всички групи (Скала = 50 µm). Панел (C) Имунохистохимично оцветяване, показващо CD68 положителни клетки в съответните групи. (Скала = 50 µm) (D) Количествен анализ на процентната площ на липидите (включително луменната област) в съответните групи (E) Количествен анализ на CD68 положителното маркиране в съответните групи. ** p ## p ### p Фигура 3. Двуфазно издигане и последваща регресия на смляно вещество и матрица металопротеиназа-9.

Панел (A) Представителни изображения на моват пентахром оцветени участъци от всички групи (Скала = 50 µm). Панел (B) Имунохистохимично оцветяване, показващо MMP-9 положителна площ на всички групи (скала = 50 µm). (C) Количествен анализ на оцветената в синьо синьо зона в съответните групи (D) Количествен анализ на MMP-9 положителни области в съответните групи (E) Артериална експресия на мРНК на MMP-9 (промяна в пъти над нормалното) във всички групи, определена в реално време PCR (F) Артериална експресия на mRNA TIMP-1 (промяна в пъти над нормалното) във всички групи, както се определя от PCR в реално време. ** p # p ## p ### p Фигура 4. Колаген (оцветяване в червено от Сириус) и съдържание на гладки мускули на α-актин в различни групи.

Панел (A) Представителни изображения на червено оцветена част от Siruis на всички групи под поляризирана светлина. Яркото изображение на същия раздел се показва като вложка (Мащабна лента = 50 µm). Панел (Б) Имунохистохимично оцветяване на α-актин в участъци от всички групи (скала = 50 µm). (C) Количествен анализ на а-актин позитивно оцветена област в съответните групи (D) Експресия на мРНК на артериалния колаген I (промяна в пъти над нормата) във всички групи, определена чрез PCR в реално време (E) Експресия на мРНК на артериален колаген III (промяна в пъти нормално) във всички групи, както се определя от PCR в реално време. *** p ### p Фигура 5. Изследвания на вазореактивност на увредена илиачна артерия от всички групи.

Съдържанието на колаген и мускули в плаките и тяхната реорганизация се предлага да играят ключова роля в поддържането на стабилността на плаката [45]. Колагенът тип I и III представлява 80% –90% от общия колагенов протеин в атеросклеротичните лезии. Съобщава се, че тип III колаген е основният тип колаген, присъстващ в нормалната артериална стена, докато тип I е преобладаващият колаген в атеросклеротичните лезии [45]. Оцветяването с колаген на изходната група в този модел потвърждава този факт (Фигура 4). Доказано е, че понижаването на липидите благоприятства натрупването на колаген с намалена експресия и активност на MMPs [22]. Следователно, прогресивно увеличаване на натрупването на интерстициален колаген в зоната на плаките на късните регресивни групи (Reg 16 седмица до Reg 64 седмица) може да се дължи на намален MMP-9, макрофаги и други провъзпалителни цитокини, които позволяват натрупването на артериална извънклетъчна матрица макромолекули като интерстициален колаген. Едновременно с това мускулното съдържание в групите с късна регресия също постепенно се нормализира, което показва характеристики на стабилна плака.

Трябва да се разбере, че регресията на плаката не е просто пренавиване на последователностите на прогресията на лезията, а вместо това включва мобилизиране на патологични компоненти на плаката чрез промяна на специфични про-атерогенни клетъчни и молекулярни пътища. Резултатите подкрепят настоящите клинични концепции, че дългосрочната реорганизация на плаката води до стабилизиране на плаката поради нормализирани атерогенни условия. Изглежда, че тези компоненти са напълно обърнати при хора, които имат значително и продължително понижаване на плазмените липиди [55]. Трябва също да се отбележи, че дали намаляването на тежестта на плаката е свързано с подобрени резултати е спекулативно при хората. Предварителните данни обаче показват, че дори малка регресия на плаката може да е достатъчна, за да доведе до клинична полза [56].

Понастоящем има голяма неудовлетворена нужда от директно модифициращо заболяването лекарство при атеросклероза. Една от причините може да се дължи на липсата на пълно патологично разбиране на атеросклерозата на различни места на артериите в предклинични модели, което води до клиничен неуспех на разследващите агенти. Следователно има спешна нужда да се характеризират атеросклеротичните характеристики на различни места на артериите в животински модели и да се интерпретират резултатите от тази гледна точка. По-голямата част от артериите, използвани за изследвания на атеросклероза при зайци, са каротидни, аортни, илиачни и бедрени. Сравнението между главите на атеросклерозата на тези места при подобни експериментални условия не само ще спомогне за поддържането на еднаквост в предклиничното разбиране на специфичните промени в артерията, но и ще ускори откриването на лекарства за атеросклероза.

Заключения

Резултатите от проучването показват, че атеросклеротичната илиачна артерия на зайци от NZW има характеристики на човешки нестабилни плаки след кратък период на отстраняване на AD. Също така, колективни промени в вътреклетъчните и извънклетъчните липиди на плаките, възстановяване на функционалността на ендотела, увеличаване на фиброзния компонент (колаген и SMC), намалена металопротеиназа и модулация на регресия на плака, експресирана от генната експресия, свързана с този модел (Фигура 6). Изследването не само ще помогне на изследователите да дефинират процеси, участващи в стабилизиране или дестабилизиране на структурите на плаката, но също така ще предостави вероятния прозорец за оценка на нови химични образувания при регресия на атеросклерозата в този модел.

Схематична еволюция на атеросклероза в балонно ранена заешка илиачна артерия при отнемане на атерогенна диета за период от 1,4 години.

подкрепяща информация

Фигура S1.

Хистологични примери за морфологични промени в заешки плаки от различни групи, оцветени с Movat Pentachrome. A = IEL дублиране на мястото на IEL счупване (всички групи с изключение на Normal), B = медиално дублиране на еластични влакна (всички групи с изключение на Normal), C = Фокално медиално разбиване с IEL разбивка (раздел на изходната група), D = медиална фиброзна реакция ( Раздел на изходната група), E = Липидно ядро ​​с отлагане на извънклетъчни липиди и пяна (Раздел на изходната група), F = Медиално разпадане без счупване на EEL (раздел 8 седмици), G = Фокална медиална компресия, простираща се към атрофия (Рег. 8-седмична секция) ), H = Медиална атрофия (Reg 8-седмична секция), I = IEL счупване без увреждане на средата (Reg 64-седмична секция) и J = Фокални цепнатини на холестерола (Reg 50-седмична и Reg 64-седмична секция). Мащабна лента = 50 µm.

Фигура S2.