Резюме

Нулеви мъжки мишки на андрогенен рецептор (AR) (AR L−/Y) разкриват затлъстяване с късно начало, което е потвърдено чрез анализ на телесния състав на базата на компютърна томография. AR L−/Y мишките бяха евфагични в сравнение с дивия тип мъжки контроли (AR X/Y), но те също бяха по-малко динамични и консумираха по-малко кислород. Профилирането на транскриптите показва, че AR L−/Y мишките имат по-ниски транскрипти за термогенетичния разединяващ протеин 1, за който впоследствие е установено, че зависи от лиганда от AR. Също така открихме засилена секреция на адипонектин, който е сенсибилизиращ инсулина, от мастна тъкан и относително по-ниска експресия на активиран от пероксизомен пролифератор рецептор-γ в бяла мастна тъкан в сравнение с AR X/Y мишки. И двата фактора могат да обяснят защо цялостната инсулинова чувствителност на AR L−/Y мишки остава непокътната, въпреки очевидното им затлъстяване. Резултатите разкриха, че AR играе важна роля в мъжкия метаболизъм, като влияе на енергийния баланс и е отрицателен както за затлъстяване, така и за чувствителност към инсулин.

мишки

  • AR, андрогенен рецептор
  • НЕТ, кафява мастна тъкан
  • КТ, компютърна томография
  • PPAR-γ, активиран от пероксизомен пролифератор рецептор-γ
  • UCP, отделящ протеин
  • WAT, бяла мастна тъкан

Етиологията на затлъстяването е изключително разнородна, тъй като е крайният резултат от взаимодействията между генетични, екологични и психосоциални фактори. Генът за андрогенен рецептор (AR) може да бъде един от тези генетични фактори. Показано е, че вариацията на повторение на AR гена е силно свързана с централните индекси на затлъстяването при възрастни възрастни (1). Тестостеронът е важен фактор за определяне на телесния състав при мъжете. Коремното затлъстяване е обратно свързано със серумните нива на тестостерон при мъжете, но не и при жените (2). Постоянното увеличаване на телесната мастна маса придружава възрастово зависимото намаляване на серумните нива на тестостерон при мъжете (3,4), което води до по-голяма заболеваемост (5). Патологично хипогонадалните мъже също имат значително по-висока мастна маса (3,6), която се обръща от прилагането на тестостерон (7,8), докато потискането на серумния тестостерон при здрави млади мъже увеличава процента на мастната маса и намалява скоростта на окисляване на липидите и енергията в покой разходи (9).

Генерирахме AR нулева (ARKO) линия на мишка, използвайки система Cre-loxP (10–12), и установихме, че мъжките ARKO мишки (AR L−/Y) развиват затлъстяване с късно начало, докато нито хетерозиготни, нито хомозиготни женски ARKO мишки са били засегнати (10), което предполага специфичен за мъжете AR ефект върху затлъстяването.

Тук ние докладваме основния механизъм на късното затлъстяване при AR L−/Y мишки. Въпреки липсата на хиперфагия, AR L−/Y мишките имат по-ниска спонтанна активност и намалено съотношение на обща консумация на кислород. Също така наблюдавахме съпътстващо намаляване на експресията на термогенния разединяващ протеин 1 (UCP-1). В допълнение, уникалната липса на инсулинова резистентност при AR L−/Y мишки, въпреки фенотипа със затлъстяване, предполага, че това е свързано с повишена секреция на адипонектин от мастната тъкан.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

ARKO мутантна мишка линия е създадена и поддържана, както е описано по-горе (10-12). Хетерозиготни женски са отглеждани на мъжки от див тип (C57BL/6NCrj; река Чарлз Япония, Токио, Япония), за да произвеждат ARKO мъжки мишки (AR L−/Y) и хетерозиготни женски. Диетата им (диета CLEA за гризачи CE-2; Kyudo, Tosu, Saga, Япония) имаше следния състав: 54,4% въглехидрати, 24,4% протеини, 4,4% мазнини и 342,2 kcal/100 g. Мишките се претеглят седмично и консумацията на храна се измерва чрез претегляне на останалата храна на всеки 3 дни. Всички протоколи за животни са одобрени от комитета за грижа и употреба на животните от университета в Кюшу.

Анализ на състава на телесните мазнини.

За анализ на компютърна томография (КТ) на състава на телесните мазнини мишките се анестезират с интраперитонеални инжекции на пентобарбитал натрий (Nembutal; Dainippon Pharmaceutical, Осака, Япония) и след това се сканират с помощта на експериментална животинска CT система LaTheta (LCT-100M) (Aloka, Tokyo, Япония). За количествена оценка бяха използвани съседни 2-милиметрови изображения между L2 и L4, използвайки софтуера LaTheta (версия 1.00). Висцералните мазнини, подкожните мазнини и мускулите бяха разграничени и оценени количествено.

Спонтанна активност.

Спонтанната физическа активност беше измерена с помощта на инфрачервена система Letica (Panlab, Барселона, Испания). Мишките бяха поставени в инфрачервена рамка 45 × 45 cm 2, в която 16 × 16 прихващащи инфрачервени светлинни лъчи образуваха двойна мрежа от инфрачервени клетки. Положението на мишките в инфрачервената рамка беше проследено в реално време. Допълнителна горна инфрачервена рамка беше приложена за откриване на отглеждане (мишка, изправена на задните си крака). Параметри като изминато разстояние, скорост, брой за отглеждане и продължителност бяха анализирани с помощта на програмата Acti-Track. Чрез задаване на два прага на скоростта от 2,00 и 5,00 cm/s, движенията бяха класифицирани в покой (по-бавно от 2,00 cm/s), бавно движение (между 2,00 и 5,00 cm/s) и бързо движение (по-бързо от 5,00 cm/s ). Мишките бяха поставени в рамката 5 часа преди започване на запис, за да се даде възможност за запознаване с околността. Записът започна 2 часа след изключване на осветлението и продължи 8 часа; мишките се оценяват индивидуално.

Измервания на разхода на кислород.

Мишките бяха хранени с редовен чау, поддържани при постоянна стайна температура (21–23 ° C) и подложени на измервания на консумацията на кислород на възраст ∼22 седмици с помощта на компютърно контролиран индиректен калориметър с отворен кръг (Oxymax; Columbus Instruments, Columbus OH ). Мишките бяха настанени индивидуално в метаболитни камери (10 × 20 cm 2) и имаха свободен достъп до храна и вода. След 1-часова адаптация към камерата, V o 2 се оценява на интервали от 4 минути в продължение на 24 часа. Всички примерни данни са анализирани с помощта на софтуера Oxymax Windows (версия 1.0).

Тестове за толерантност към глюкоза и инсулин.

За интраперитонеалния тест за толерантност към глюкоза, мишките гладуват цяла нощ и след това се инжектират с 2 g d -глюкоза/kg телесно тегло i.p. Нивата на кръвната захар в опашката се наблюдават преди и на 15, 30, 60, 90 и 120 минути след инжектирането с помощта на измерватели на кръвната захар (Matsushita Kotobuki Electronics Industries, Ehime, Япония). За теста с предизвикателство за инсулин, мишките са гладували цяла нощ и след това се инжектират с 0,7 единици редовен инсулин/kg телесно тегло i.p. Нивата на кръвната захар в опашката се измерват в същите часови точки, както по-горе.

Хистология.

Мишките бяха убити на 45 седмици след гладуване през цялата нощ и кръвта беше събрана чрез сърдечна пункция. Подкожната бяла мастна тъкан (WAT), междускапуларната кафява мастна тъкан (BAT), черният дроб и бъбреците бяха отстранени и фиксирани с потапяне в 4% параформалдехид. След дехидратация тъканните проби бяха вградени в произволна ориентация с парафин, нарязани на 10-μm участъци и оцветени с хематоксилин и еозин.

Химикали в кръвта.

Кръвта се събира по време на смъртта и изолираният серум се разпределя аликвотно и се съхранява при -20 ° C до употреба. Всички химични елементи на кръвта бяха измерени от SRL (Токио, Япония). Плазмените нива на адипонектин в пълна дължина са измерени с помощта на ензимно свързана имуносорбентна система за анализ, както е описано по-рано (13).

PCR в реално време.

Обща РНК се изолира от 100 mg интраперитонеална WAT или междулопаточна BAT с помощта на RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния). За да се отстрани евентуално замърсяване с ДНК, се извършва смилане на ДНК в колона с набор от без RNase DNase (Qiagen). След това 3 μg от общата РНК се подлагат на обратна транскрипция, като се използва SuperScript III обратна транскриптаза (Invitrogen, Carlsbad, CA), грундирана от произволни праймери. След това cDNA беше подложена на PCR анализ в реално време, за да се определят количествено различни транскрипти, като се използва LightCycler (Roche Diagnostics, Манхайм, Германия) съгласно инструкциите на производителя, както описахме по-рано (14). Правата/обратната праймерни последователности за всеки целеви транскрипт са показани в Таблица 1. β-актинът се усилва едновременно като вътрешен контрол. PCR данните в реално време за всеки транскрипт са изчислени като съотношението на β-актин.

UCP-1 промоторен тест.

3.85-kb (-3.860 до -10 от стартовия кодон) регион на миши промотор UCP-1 се усилва чрез PCR, използвайки специфични праймери (Таблица 1) и KOD-Plus ДНК полимераза (Toyobo, Osaka, Japan) в T -градиентен термоблок (Biometra Biomedizinische Analytik, Gottingen, Германия) и впоследствие беше клониран във pGL3-Basic (Promega, Madison, WI) вектор, за да се изгради репортер на UCP-1-Luc. След това беше извършено директно секвениране, за да се провери последователността и ориентацията в пълна дължина. Ефектът на AR върху промотора на UCP-1 е анализиран в адипоцитите на NIH-3T3-L1 чрез двойния луциферазен анализ, както е описано по-горе (15). Накратко, 1 × 105 клетки/гнездо бяха засяти в плаки с 12 ямки и UCP-1 – Luc и pCMV-AR, или pCMX (празен вектор), заедно с вътрешния контролен pRL-CMV вектор бяха котрансфектирани в клетките чрез SuperFect (Qiagen). Клетките се инкубират в 10 -8 mol/l дихидрокситриптамин или неговия разтворител, етанол, в продължение на 24 часа и след това се лизират и подлагат на относителния анализ на луцифераза, използвайки луминометър LUMAT LB9507 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Германия).

Статистически анализ.

Данните бяха изразени като средни стойности ± SD и оценени чрез двустранен t тест на Student или ANOVA, последвано от post hoc сравнения със защитения тест за най-малка значима разлика на Fisher.

РЕЗУЛТАТИ

Преди това съобщавахме, че на възраст до 10 седмици мишките AR L−/Y имат забавяне на растежа в сравнение с мъжките мишки от див тип (AR X/Y), но през следващите няколко седмици телесното им тегло наваксва и след това надвишава тази на AR X/Y мишки и в крайна сметка се развива в явно затлъстяване (10). Тези явления не са наблюдавани при ARKO женски мишки. В настоящото проучване направихме обективен анализ на телесния състав на базата на CT за мишки на възраст 40 седмици. Фигура 1А показва CT-оценените тегла на мастната тъкан и мускулите в изследваната област (L2 – L4). Въпреки че количеството мускули е непроменено, висцералните и подкожните мазнини и общата мазнина на AR L−/Y мишки са значително по-тежки от тези на AR X/Y мишки. Фигура 1В показва представителни CT изображения на ниво L3 на AR X/Y (вляво) и AR L−/Y (вдясно) мишки. AR L−/Y мишките са имали повишено съдържание на мазнини както във висцералната, така и в подкожната област. По този начин, повишената затлъстяване, а не линейното нарастване на телесния растеж, отчита повишеното телесно тегло на AR L−/Y мишки.

Телесното тегло на AR L−/Y мишки на 45-седмична възраст е значително по-високо от това на AR X/Y мишки (фиг. 2А) и, в съответствие с CT данните, периренални мастни накладки на AR L−/Y мишки са били ясно по-големи от тези на AR X/Y мишки (данните не са показани). Въпреки повишеното телесно тегло, бъбреците на AR L−/Y мишки са значително по-малки от тези на AR X/Y мишки (фиг. 2Б), подкрепяйки предишни проучвания, демонстриращи по-малки бъбреци при орхидектомизирани мишки (16,17).

След това изследвахме молекулярните събития на метаболизма на глюкозата в скелетните мускули, тъй като мускулите също са основна цел на андрогена и адипонектина. Както е показано на фиг. 3I – M, въпреки че нивата на GLUT1 транскрипт са непроменени (данните не са показани), нивата на GLUT4 (мускулно доминиращ тип) при AR L−/Y мишки са значително увеличени. Доминиращата в мускулите хексокиназа I също беше с повишено регулиране, въпреки че не беше установена промяна за хексокиназа II. Мускулният тип фосфофруктокиназа има тенденция, макар и не статистически значимо, да бъде по-висок, докато увеличението на мускулния тип пируват киназа (включително мускулен тип пируват киназа-1 и -2) достига статистическа значимост. Тези данни предполагат, че усвояването и окисляването на глюкоза в мускулите може да се активира при AR L−/Y мишки.

Концепцията за енергиен баланс, която включва както енергиен прием (хранене), така и енергийни разходи (физическа активност, основен метаболизъм и адаптивна термогенеза), е ключът към разбирането на затлъстяването (24). Първо установихме, че приемът на храна ad libitum е непроменен между AR L−/Y и AR X/Y мишки; тоест AR L−/Y мишките бяха евфагични, както вече беше съобщено (10). След това измерихме спонтанната физическа активност за мишки на възраст около 8, 20 и 40 седмици (Таблица 2). По време на 8-часовия период на наблюдение, докато светлините не бяха изключени, 20-седмичните мишки AR L−/Y изминаха значително по-кратко разстояние и показаха почти половината от броя на поведението на отглеждане (изправяне на задните крака), друг важен параметър на динамично поведение в сравнение с AR X/Y мишки. AR L−/Y мишките също показват намалена активност на 40-седмична възраст и, което е важно, на 8-седмична възраст, когато телесното тегло на AR L−/Y мишки все още не е надвишавало това на AR X/Y мишки. Това предполага, че намалената активност на AR L−/Y мишки е присъщ дефект, но не и вторичен ефект на мишките с наднормено тегло.

В WAT на AR L−/Y мишки, нивото на експресия на най-важната термогенетична молекула, UCP-1 (26), е по-малко от една десета от това при AR X/Y мишки (Фиг. 5А). AR вероятно е нов положителен регулатор на гена UCP-1, тъй като разкрихме три елемента на отговор на стероидния рецептор (TGTTCT) в промоторна последователност на UCP-1 (до -7,645 bp, номер на присъединяване на GenBank U63418) и 3,85 kb UCP-1 промоторът, който съдържа последната консенсусна последователност, реагира положително на AR в адипоцитите на NIH-3T3-L1 по дихидротестостерон-зависим начин (Фиг. 5В). Намаляване на UCP-1 транскрипта се наблюдава и при НДНТ на AR L−/Y мишки (Фиг. 5С), въпреки че е по-малко преобладаващо от това при WAT; това обаче се обяснява със седемкратно по-високата експресия на AR транскрипт в мъжки WAT от BAT (фиг. 5D). Понижаването на регулирането на UCP-1 може да обясни до известна степен по-ниското V o 2 при AR L−/Y мишки. В допълнение, друг термогенетичен фактор, PPAR-γ коактиватор 1 (27), също е значително намален както при WAT, така и при НДНТ на AR L−/Y мишки (Фиг. 5E и F).

Хормоночувствителната липаза катализира ограничаващата скоростта стъпка на липолиза в мастната тъкан. Нивото на транскрипт на хормоночувствителна липаза е значително намалено в AR L−/Y WAT (фиг. 6А), докато тези за индикатори за ново ново синтезиране на липиди, като синтаза на мастни киселини (фиг. 6Б) и ацетил-КоА карбоксилаза (фиг. 6C), както и липогенният транскрипционен фактор стерол регулаторен елемент-свързващ протеин-1с (фиг. 6D), не са се променили значително както в WAT, така и в BAT (данните не са показани). Установено е, че транскриптите, кодиращи липопротеинова липаза, ключовият ензим, участващ в липогенезата от циркулиращия плазмен триглицерид, значително намаляват в AR L−/Y WAT (фиг. 6Е). Маркерите за β-окисление на мастната киселина карнитин палмитоил трансфераза 1 (фиг. 6F) и дълговерижната ацил-CoA дехидрогеназа (фиг. 6G) в AR L−/Y WAT показват по-ниски тенденции, но те не са статистически значими. Като цяло, намалената липолиза, а не увеличеният синтез на липиди може да обясни повишеното затлъстяване при AR L−/Y мишки.

ДИСКУСИЯ

Директният молекулярен механизъм, отчитащ хипертрофични адипоцити и разширена WAT на AR L−/Y мишки, може да разчита на променената липидна хомеостаза, характеризираща се с намалена липолиза, но не и с повишена липогенеза. Транскриптите за чувствителна към хормони липаза са поразително намалени, докато тези за липогенетичните гени (синтаза на мастни киселини, ацетил-КоА карбоксилаза, протеин-1с, свързващ стерол регулаторен елемент и липопротеин липаза) не се увеличават (непроменени или намалени). Резултатите са в съответствие с предишни предположения, че андрогените са липолитични (28,29) и са много различни от тези на нокаутиращите мишки с ароматаза, при които е установено, че липогенезата е засилена (висока липопротеинова липаза), но липолизата е нормална (30), което предполага, че естрогенът е антилипогенен.

Установено е, че молекулярните събития зад интактната хомеостаза на глюкозата, усвояването на глюкозата и окислението са засилени в скелетните мускули чрез AR инактивиране, отразявайки клиничната картина на пациентите със синдром на поликистозните яйчници, където излишъкът на андроген е свързан с инсулиновата резистентност (32) и нарушеното усвояване на глюкоза ( 38). Към този момент обаче не сме сигурни дали засиленото поемане и окисление на глюкоза се причинява директно от инактивирането на андроген-AR системата или е вторично за хиперадипонектинемията или ниската експресия на PPAR-γ.

Теглото на тялото и съхраняването на енергия като триглицериди в мастната тъкан се хомеостатично регулират от дългосрочния баланс между енергийния прием и разход; затлъстяването се развива само ако енергийният прием хронично надвишава общия енергиен разход (24). Въпреки че не засяга апетита, AR инактивирането причинява вътрешно намаляване на спонтанната физическа активност при мъжки мишки, както и общата консумация на кислород (V o 2). По този начин инактивирането на андроген-AR системата при мъжки мишки причинява хроничен положителен енергиен баланс, който благоприятства ускоряването на мастната маса и затлъстяването.

В съгласие с долните V o 2, както термогенните UCP-1, така и PPAR-γ коактиваторите 1 транскрипти са намалени в мастните тъкани на AR L−/Y мишки. UCP-1, който отделя окисляването на енергиен субстрат от производството на митохондриални АТФ и следователно води до загуба на потенциална енергия като топлина, е една от най-важните молекули, отговорни за адаптивната термогенеза (26). Доколкото ни е известно, това е първият път, когато е показано, че AR, след своето свързване с лиганд, директно активира UCP-1 транскрипция, вероятно чрез свързване към елементите на стероидния отговор на промотора.

Въпреки че AR директно регулира фактори в периферните тъкани, участващи в енергийната хомеостаза, като UCP-1, той също много вероятно влияе върху механизма, упражняван от централната нервна система, тъй като AR е открит плътно експресиран в различни ядра на хипоталамуса, включително вентромедиалния хипоталамус и дорзомедиалния хипоталамус и дъгообразното ядро ​​(39). Андроген-активиращата 5α-редуктаза също се експресира в хипоталамуса (40). Физиологичната роля на андроген-AR системата в хипоталамуса е до голяма степен неизвестна. Изключително вероятно е рецепторът да участва в регулирането на регулирания с лептин меланокортинов кръг, тъй като AR активирането в хипоталамуса увеличава инхибиторния невропептид соматостатин (41,42), който от своя страна може да инхибира анорексигенния меланоцит-стимулиращ хормон или кокаин- и транскрипт, регулиран от амфетамин. Промененият енергиен баланс в AR L−/Y, характеризиращ се с по-ниско V o 2 и по-ниска физическа активност, изисква по-нататъшно проучване на ролята на AR в централната нервна система, което в момента продължава.

В обобщение, андроген-AR системата корелира с мъжкото затлъстяване и инактивирането на системата причинява късно затлъстяване при мъжки мишки поради променен енергиен баланс, тъй като AR L−/Y мишките са евфагични, но по-малко физически динамични и по-малко кислород -консумиращи в сравнение с AR X/Y мишки. Механизмът на намаления разход на енергия може да се намира както в централната нервна система, така и в периферните тъкани. Освен отрицателната си роля при затлъстяване, андроген-AR системата играе и отрицателна роля за инсулиновата чувствителност, поне отчасти чрез инхибиране на освобождаването на адипонектин от мастната тъкан.