Ирина Третякова

1 Medigen, Inc., 4539 Metropolitan Court, Frederick, MD 21704, САЩ

Игор С. Лукашевич

2 University of Louisville, 505 S Hancock St., Louisville, KY 40202, САЩ

Памела стъкло

3 Американски армейски изследователски институт по инфекциозни болести, 1425 Porter St., Фредерик, MD 21702, САЩ

Ерю Уанг

4 Институт за човешки инфекции и имунитет, Sealy Center за разработване на ваксини и Катедра по патология, Медицински клон на Тексаския университет, GNL, 301 University Blvd., Galveston, TX 77555, САЩ

Скот Уивър

4 Институт за човешки инфекции и имунитет, Sealy Center за разработване на ваксини и Катедра по патология, Медицински клон на Тексаския университет, GNL, 301 University Blvd., Galveston, TX 77555, САЩ

Петър Пушко

1 Medigen, Inc., 4539 Metropolitan Court, Frederick, MD 21704, САЩ

Резюме

1. Въведение

Експерименталната, атенюирана жива ваксина TC-83 [12] понастоящем е единствената жива ваксина, използвана съгласно протокола Investigational New Drug (IND) за имунизация на медицински персонал в риск [7, 13, 14]. Ваксината TC-83 осигурява защита срещу много епизоотични вируси от комплекса VEEV [15], включително IAB, IC и IE. Ваксината обаче може да причини неблагоприятни ефекти като главоболие и треска при приблизително 23% от ваксинираните. Други приблизително 18% от получателите на ваксина не развиват достатъчно неутрализиращи титри на антитела [16]. Генетичните реверсии във вируса TC-83 са свързани с неблагоприятни ефекти [17]. РНК вирусите имат високи нива на мутации [18, 19], които допринасят за генетична нестабилност и натрупване на потенциално вредни мутации по време на вирусни пасажи за производство на ваксини.

Поради дългия си опит в клиничната употреба, TC-83 представлява логична отправна точка за приготвяне на по-безопасна и по-добра ваксина срещу VEEV [17]. Тук описваме нова имунизационна ДНК (iDNA) ваксинна платформа, която потенциално може да преодолее слабостите на ваксината TC-83, като комбинира предимствата на ДНК имунизацията с ефикасността на атенюираната жива ваксина. PTC83 iDNA ваксината представлява рекомбинантен плазмид, който кодира цялата геномна РНК на вирус TC-83 под контрола на еукариотния промотор. След ваксинация, iDNA плазмидът управлява транскрипцията на вирусна РНК in vivo и инициира ограничена репликация на генетично дефиниран, TC-83-подобен ваксинен вирус. По този начин, жива атенюирана ваксина се пуска от iDNA in vivo, без нужда от външни клетъчни субстрати или вирусни пасажи за производството на ваксини, което минимизира потенциала за реверсии или неблагоприятни ефекти, осигурява генетична стабилизация и води до ефективна имунизация. По този начин, технологията iDNA ваксина позволява ефективно превръщане на ДНК имунизацията в силно имуногенна жива атенюирана ваксина и комбинира предимствата на двете ваксинални платформи.

2. Материали и методи

2.1. Клетки и вируси

Бъбрек за бебе хамстер (BHK-21), яйчник на китайски хамстер (CHO) и клетъчни линии Vero са получени от Американската колекция за култури на типове (Manassas, VA) и се поддържат в овлажнен инкубатор при 37 ° C в 5% CO2 в αMEM, допълнен с 10% фетален говежди серум (FBS) и гентамицин сулфат (10 µg/ml) (Life Technologies, Carlsbad, CA). Живо-атенюираната ваксина TC-83 е получена от Командването за медицински изследвания и материали на Американската армия (Fort Detrick, MD), амплифицирана веднъж в клетки CHO и съхранявана при -80 ° C. Щамът на магарето Тринидад от VEEV, подтип IAB от 1943 г. изолат от епидемия/епизоотия [20], е стандартен изпитателен запас и е използван в Медицинския изследователски институт по инфекциозни болести на САЩ (USAMRIID, Fort Detrick, MD). Вирусът на щама VEEV 3908, изолат на IC епидемичен подтип от 1995 г. (Weaver et al., 1996), е стандартен изпитателен запас, използван в медицинския клон на Тексаския университет (UTMB, Galveston, TX).

2.2. Приготвяне на плазмиди и iDNA

TC-83 ваксинен вирус се размножава в СНО клетки в 75 cm 2 колба. На 48 часа след заразяването вирусът се събира, избистря и замразява при -80 ° С в 1 ml аликвотни части. Вирусната РНК се извлича от Trizol LS (Life Technologies). Четири cDNA фрагмента се генерират чрез използване на едноетапна RT-PCR система със специфични олигонуклеотидни праймери. След това, cDNA фрагменти бяха събрани в получения от pcDNA3.1 плазмид под контрола на CMV промотор.

2.3. Трансфекции и in vitro анализи

CHO и Vero клетките се трансфектират чрез електропорация на плазмидна iDNA при концентрации, вариращи от 8 ng до 5 ug в 75 cm 2 колби. Трансфекцията на CHO и Vero клетки се извършва по същество, както е описано по-горе [21]. Като контрола, клетките бяха заразени с 10 2 до 10 5 PFU на вирус TC-83. За кривите на растежа на вируса, вирусни проби се събират на определени интервали и се определят количествено в два екземпляра чрез стандартен анализ на плака в клетки Vero.

2.4. Имунизации и предизвикателство

IDNA плазмидът се изолира от E.coli чрез метод без ендотоксини (Qiagen, Валенсия, Калифорния) и се формулира във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) до концентрация от 1 mg/ml. Преди ваксинации, триседмични женски мишки BALB/c са анестезирани с изофлуран. Мишките бяха ваксинирани интрамускулно (i.m.) с 50 ul iDNA в медиалните бедра, последвано от in vivo електропорация при амплитуда 100 V с продължителност на импулса 50 msec и интервал между импулсите от 200 msec. Контролира по подобен начин несвързана pcDNA3.1-базирана плазмидна ДНК в PBS. Животните се електропорират на мястото на инжектиране с помощта на двупинов електрод и електропоратор с квадратна вълна (ECM 830, BTX Genetronics, Сан Диего, Калифорния). Кръвни проби бяха събрани от ретро-орбиталния синус за откриване на виремия в продължение на 3 дни след ваксинация чрез усилване на плазмен вирус с клетки Vero. За да се потвърди, че ваксинният вирус, пуснат от iDNA in vivo, поддържа последователността TC-83 E2, генът E2 от плазмения вирус се усилва, като се използват следните праймери: 8559-GGAGATCCACCGAGGAGCTG-8578; 9157-GGAATGCGAGTGTGGCGGCAC-9177; 9190-GGCGGCACAAAGATCTCCGAG-9170; и 9850-GCCGAGACCACCTGGGAGTCC-9830. Е2 сДНК фрагментите се клонират в pCR2.1-TOPO и се определя ДНК последователност.

След ваксинации животните се наблюдават ежедневно за клинични признаци на инфекция и телесното тегло се определя на 1–7, 14 и 21 ден след ваксинацията. Серумите са събрани на 21-ия ден след ваксинацията, малко преди вирусно предизвикателство. Western blot, анализ за неутрализиране на плака (PRNT) и непряк имунофлуоресцентен анализ (IFA) бяха извършени за определяне на отговорите на антителата към TC-83. След това мишките бяха прехвърлени в съоръжение BSL3 и предизвикани с вирулентен VEEV щам 3908 в доза 10 5 PFU в 100 ul по подкожен (s.c.) път. Взеха се кръвни проби за откриване на виремия в продължение на 3 дни след предизвикване. Алтернативно на електропорацията, iDNA ваксинацията на BALB/c/мишки с pTC83 се извършва чрез използване на in vivo реагент за трансфекция. Полимерът за доставка на ген TransIT (Mirus, Madison, WI) се използва за трансфекция на iDNA ваксина интравенозно (i.v.), съгласно инструкциите на производителя. Статистическата значимост на разликите в титрите на вируса между ваксинираните и контролните животни се определя чрез тест на Student.

2.5. Серология

Неутрализиращите антитела срещу TC-83 вируса бяха определени в клетките Vero чрез PRNT80. Серологичните анализи включват също Western blot и IFA. За Western blot, вирусните протеини TC-83 бяха разделени, използвайки 4-12% градиент SDS-PAGE и изследвани с миши антисеруми. За IFA, CHO клетки се отглеждат в 8-ямкови камерни предметни стъкла и пробите от вируса се разреждат с 10-кратни стъпки в αMEM, съдържащи 10% FBS и се абсорбират (0,1 ml/ямка) върху CHO клетъчни монослоеве за 1 h при 37 ° C . След това се добавят 0,3 ml от средата на гнездо и инкубацията продължава за посочените времена. Клетките се фиксират със студен ацетон и се сондират с посочени антисеруми, последвани от белязан с флуоресцеин IgG (H&L).

3. Резултати

3.1. Получаване на pTC83 iDNA

Четири cDNA фрагмента, получени от TC-83 вирусна РНК чрез RT-PCR, бяха комбинирани в рамките на pcDNA3.1-получения плазмид, което доведе до pTC83 iDNA плазмид, съдържащ пълната дължина на cDNA на TC-83 геномна РНК надолу по веригата от основната CMV непосредствена- ранен промотор (фиг. 1а). Тъй като автентичните 5 ’и 3’-краища на РНК са от решаващо значение за репликацията на алфавирус [8], разстоянието между CMV промотора и началото на транскрипцията на РНК полимераза е оптимизирано, за да осигури транскрипция на функционалната TC-83 геномна РНК. Последователност на рибозим, получена от хепатит делта вирус, беше вмъкната надолу по веригата от TC-83 3’-терминалната поли-А последователност.

нова

(а) Схематично представяне на pTC83 плазмид. Посочени са местата за ограничение, използвани за подготовка на клонинга TC-83 с пълна дължина.

(b) Непряк анализ на имунофлуоресценция (IFA) на CHO клетки, трансфектирани с pTC83 iDNA. IFA се извършва на 24 часа (ляв панел) и 48 часа след електропорация. За да се визуализират ядра в трансфектирани клетки, се използва 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) оцветяване.

(c) Western blot на CHO клетки, трансфектирани с pTC83 iDNA (ляв панел) и анализ на плаката на супернатанта от CHO клетки, трансфектирани с pTC83 iDNA (десен панел). Уестърн блот се извършва на 24 часа след електропорация, като се използва ATCC антисерум срещу VEEV. Анализът на плаката се провежда в монослоеве Vero клетки.

(d) Репликация на произведен от iDNA вирус TC-83 в заразени Vero клетки. Vero клетките бяха заразени със 100 PFU от iDNA-получен TC-83 вирус. Титърът на плаката се определя в дубликати, лентите за грешки не се виждат в показания мащаб на регистрационния файл.

3.2. Генериране на вирус от iDNA in vitro

PTC83 iDNA ваксината се трансфектира в СНО клетки чрез електропорация. Трансфектираните клетки бяха засяти в камерни предметни стъкла и експресията на TC-83 антигени беше открита чрез IFA на 24 часа след трансфекцията, като се използва ATCC TC-83-специфичен заешки антисерум (Фиг. 1b). Антигените TC-83 се експресират в цитоплазмата на трансфектирани клетки. До 48 часа всички клетки са положителни за TC-83 антигени, като по този начин потвърждават репликацията на вируса (фиг. 1Ь). Експресията на TC-83 протеините се потвърждава чрез SDS-PAGE и Western blot (фиг. 1в). Резултатите за трансфектирани Vero клетки са подобни на тези на CHO клетки (данните не са показани). Наличието на репликиращия се вирус се потвърждава чрез директен анализ на плаката на пробите от клетъчна култура (фиг. 1в), както и чрез амплификация на вируса и крива на растеж, използвайки инфекция на Vero клетки (фиг. 1г). За амплификация и крива на растеж, Vero клетките бяха инокулирани със 100 PFU от вируса, получен от pTC83 iDNA-трансфектирани CHO клетки. Инкубацията продължи 72 часа. В съответствие с предишни наблюдения [22], вирусът се репликира бързо и достигна титър от 10 9 PFU/ml в клетките на Vero при 30 часа постинфекция (фиг. 1г).

(а) IFA на CHO клетки, трансфектирани с 5 µg или 1 µg iDNA (горен панел) или с 10 5 PFU на вирус TC-83 (долен панел).

(b) Криви на растеж на вируси TC-83 в заразени с вируси и в iDNA-трансфектирани CHO клетки. В левия панел, CHO клетките са или заразени с 10 4–10 5 PFU от вируса, или трансфектирани с 0,2–5 µg pTC83 iDNA. Десен панел, CHO клетките бяха трансфектирани с 8 ng до 1 ug pTC83 iDNA. Титърът на плаката се определя в дубликати, лентите за грешки не се виждат в показаната скала.

3.3. Вирусът, генериран in vitro от iDNA, се атенюира при мишки

За да потвърдим, че TC-83 вирусът, получен от iDNA, има атенюиран фенотип in vivo, използвахме вируса, който е получен от CHO клетки, трансфектирани с pTC83 iDNA. Накратко, 10 4 PFU бяха инокулирани подкожно (s.c.) в 10 мишки BALB/c в лабораторията BSL3. За целите на контрола, десет BALB/c мишки бяха инокулирани по подобен начин с 10 4 PFU от вирулентен IAB Trinidad щам на VEEV. Всички контролни животни, получили щам Trinidad на VEEV, умряха до ден 7 след инокулация (Таблица 1). За разлика от това, всички мишки, инокулирани с вирус, получен от iDNA, остават здрави, без забележими неблагоприятни ефекти, демонстрирайки силно атенюиран фенотип на вируса при мишки BALB/c.

маса 1

Вирусът, получен in vitro от pTC83 iDNA, се атенюира при мишки BALB/c.

VirusDoseRouteMorbidityMortality
Вирус TC-83 от iDNA a 10 4 PFUs.c.0/100/10
VEEV, щам Тринидад10 4 PFUs.c.10/1010/10

3.4. Генериране на вирус от iDNA in vivo

(а) Откриване на виремия в плазмени проби, събрани от мишки BALB/c, ваксинирани с pTC83 иДНК. Мишките BALB/c се инжектират интравенозно (i.v.) със смес от pTC83 iDNA и TransIT трансфекционен реагент (Mirus, Madison, WI). Плазмени проби бяха събрани на ден 1 след инокулация и инкубирани с Vero клетки за амплификация на вируса. На 3-тия ден културната среда беше събрана и изследвана чрез титруване на плаки, използвайки Vero клетъчни монослоеве. Ляв панел, вирус TC83, възстановен от плазмата на мишки, инокулирани с iDNA. Десен панел, вирусът се възстановява от плазмата след имунизация с прототип VEEV TC-83 ваксина.

(b) Откриване на серумни антитела в плазмени проби 1–10 от pTC83 иДНК-ваксинирани мишки BALB/c, чрез IFA. Десет BALB/c мишки бяха ваксинирани чрез електропорация с pTC83 iDNA. Плазмени проби от отделни мишки се събират на 21-ия ден след ваксинацията и се сондират с монослоеве от СНО клетки, заразени с TC-83-вирус при MOI = 0,1. Плазмени проби бяха използвани при разреждане 1:20.

3.5. Имуногенност и ефикасност на iDNA ваксината при мишки

Оцеляване на мишки BALB/c след предизвикателство с VEEV. Мишките бяха ваксинирани чрез електропорация с 50 ug pTC83 iDNA. На 28-ия ден след ваксинацията мишките бяха прехвърлени в съоръжение BSL3 и предизвикани s.c. с 10 5 PFU на вируса VEEV. Мишките бяха ежедневно наблюдавани за признаци на заболяване и смърт. Наблюдава се еднаква леталност за контролни мишки, докато всички ваксинирани с iDNA мишки оцеляват.

Таблица 2

Имуногенност и ефикасност на pTC83 iDNA ваксина при мишки BALB/c.

4. Дискусия

Освен това, ние предполагаме, че iDNA може да стимулира имунната система чрез неметилирани CpG мотиви от бактериален произход и/или двуверижна структура на ДНК, което на теория може да подобри имуногенността и да намали броя на неотговарящите, въпреки че това остава да бъде тествано. Двуверижната ДНК активира стимулатора на интерферонови гени/TANK-свързваща киназа 1 (STING/TBK1) -зависими вродени имунни сигнални пътища. Установено е, че тип-I интерферони (IFN), индуцирани in vivo чрез STING/TBK1 пътя, са от решаващо значение както за директно, така и за непряко представяне на антиген чрез различни типове клетки, включително дендритни и мускулни клетки [50, 51]. IFN и IFN-индуцираните пътища участват във ваксинацията TC-83 [38]. Други имунни модулатори също могат да играят роля в репликацията на вируса [52].

В обобщение, iDNA има генетична и химическа стабилност на ДНК ваксините без изискване за студена верига. Това е важно за географските райони на VEEV с топъл климат и ограничена инфраструктура за студена верига. Освен това, подобно на живите ваксини, iDNA може да предизвика силен защитен имунитет след ваксинация с една доза, както е показано в това проучване. Доколкото ни е известно, това е първият доклад за in vivo доставка на съществуваща клинична жива атенюирана ваксина чрез използване на ДНК имунизация. Необходими са повече експерименти, включително предизвикателства с по-висока доза или множество подтипове VEEV, проучвания за дълголетието на имунния отговор, устойчивостта на iDNA вектора in vivo и изследване на органите за признаци на реплициращ се вирус след ваксинация с iDNA. Потенциално платформата iDNA може да бъде конфигурирана за други живи атенюирани вирусни ваксини и да подобри тяхното производство чрез елиминиране на много стъпки от конвенционалния производствен процес.

Акценти

Новата iDNA платформа беше използвана за ваксинация срещу алфавирус VEEV

По-малко от 10 ng от pTC83 iDNA инициира репликация на ваксиналния вирус in vitro