Свързани данни

Резюме

Въз основа на тези открития се предполага, че затлъстяването потиска синтеза на IL-10 и води до хронично възпаление в WAT и черния дроб. Нашите данни показват, че затлъстяването намалява експресията на IL-10 в далака и че IL-10, получен от далак, предпазва от възпалителни реакции в WAT и черния дроб при затлъстели мишки.

нова

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Мъжки мишки C57Bl/6J (мишки от див тип, 22–25 g; KBT Oriental, Saga, Япония) и мишки с дефицит на IL-10 (мишки IL-10KO, 002251-B6.129P2-Il10 tm1Cgn/J, подарък от Sandy Morse, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) бяха настанени в стая в университета в Оита при 12-часов цикъл светлина/тъмнина с включени светлини от 0700 h до 1900 h. Мишките IL-10KO, поддържани в нашия университет, бяха използвани за обратен кръстосване. PCR праймери на 5′-CCACACGCGTCACCTTAATA-3 ′ (мутант напред), 5′-GTTATTGTCTTCCCGGCTGT-3 ′ (див тип) и 5′-CTTGCACTACCAAAGCCACA-3 ′ (често срещани) бяха използвани за генотипиране. Всички проучвания са проведени в съответствие с насоките на университета в Оита, базирани на Ръководство за грижа и употреба на лабораторни животни, публикувано от Националните здравни институти. С всички мишки се работи в продължение на 5 минути на всеки 4 последователни дни преди експеримента (13).

Експериментален протокол

Експеримент 1.

Мишки от див тип бяха разпределени в една от двете групи (n = 6 във всяка група), както следва: мишки от група 1 бяха хранени със стандартна чау (Стандарт; 20% мазнини, 56% въглехидрати, 24% протеин; Clea, Токио, Япония) в продължение на 8 седмици и след това се подлага на фиктивна операция (Sham); мишки от група 2 се хранят стандартно в продължение на 8 седмици и след това се подлагат на спленектомия (SPX). След това се предизвиква анестезия чрез интраперитонеално инжектиране на натриев пентобарбитал (50 mg/kg), коремната кухина се отваря и далакът се отстранява внимателно. Коремът беше отворен, но далакът не беше отстранен в групата Sham.

Експеримент 2.

Мишки от див тип бяха разпределени в една от петте групи (n = 6 във всяка група), както следва: мишки от група 1 бяха хранени стандартно в продължение на 8 седмици и администрирани миши серумен албумин (m-албумин), мишки от група 2 бяха хранени с високо- мастна диета (HF; 60% мазнини, 20% въглехидрати, 20% протеин; Research Diets, New Brunswick, NJ) в продължение на 8 седмици и след това с m-албумин, мишки от група 3 бяха хранени с HF в продължение на 8 седмици след SPX и след това -албумин, мишки от група 4 бяха хранени с HF в продължение на 8 седмици след SPX и след това им беше даден рекомбинантен миши IL-10 (r-IL-10; 0,5 ng/ден; Wako Chemicals, Осака, Япония) и мишки от група 5 (хранени по двойки) група) са били хранени с количеството храна, консумирана от групата, лекувана със SPX, в продължение на 8 седмици и след това са получавали m-албумин.

Експеримент 3.

Мишки от див тип и IL-10KO бяха разпределени в една от трите групи (n = 6 във всяка група), както следва: мишки от група 1 бяха хранени с HF за 8 седмици и администрирани с m-албумин, мишки от група 2 бяха хранени с HF за 8 седмици след SPX и администриран m-албумин, а мишки от група 3 се хранят с HF в продължение на 8 седмици след SPX и се прилага r-IL-10 (0.5 ng/ден; Wako Chemicals). Приемът на храна през 24 часа се изчислява чрез претегляне на останалата храна и телесното тегло се определя между 1700 часа и 1800 часа всеки ден. Приемът на храна се нормализира според телесното тегло. Всички мишки бяха настанени за допълнителни 4 седмици след приключване на интервенциите.

Нива на цитокини в далака, WAT, черния дроб и серума.

ELISA комплекти (Invitrogen, Carlsbad, CA) бяха използвани за измерване на нивата на TNF-α, IL-1β, MCP-1 и IL-10 в далака, епидидималната WAT, черния дроб и серума. Концентрациите на протеини на всеки орган бяха анализирани с помощта на метода на Лоури. Съотношението на IL-10 към TNF-a се изчислява от горните измервания.

Уестърн блотинг.

Препаратите от замразена тъкан се хомогенизират с пробен буфер, центрофугират се и се варят. Общата концентрация на протеин в тъканта е количествено определена по метода на Брадфорд. Равни количества от общия протеин се зареждат върху 8% SDS-PAGE и след това се прехвърлят електрофоретично върху мембрани от поливинилиден дифлуорид (Bio-Rad, Richmond, СА). Мембраните бяха блокирани с 5% обезмаслено мляко за 1 h, инкубирани за една нощ с първични антитела при 4 ° С и след това инкубирани с вторично антитяло за 1 h при стайна температура. Основният разтвор на антитела се състои от поликлонален антисерум със специфичност за заек F4/80 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). F4/80 беше открит чрез засилена хемилуминесценция (Amersham Life Sciences, Piscataway, NJ) и количествено определен с помощта на софтуера за изображения Quantity One (Bio-Rad).

Хистологични и имунохистохимични анализи.

Епидидималните WAT и чернодробните проби бяха изследвани с Mayer хематоксилин-еозин (H-E) (Wako Chemicals). Чернодробни проби също бяха изследвани с оцветяване с масло-червено-O и леко оцветени с хематоксилин (Wako Chemicals). За имунохистохимично оцветяване на F4/80, предметните стъкла се инкубират с първични антитела в продължение на една нощ при 4 ° С със заешко анти-мише F4/80 антитяло (Santa Cruz Biotechnology). Слайдовете бяха инкубирани с конюгиран с биотин кози анти-заешки IgG (реагент ABC; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Имунореактивността на всяка проба се визуализира с диаминобензидин тетрахидрохлорид (Nacalai Tesque, Киото, Япония). В допълнение, вместо гореспоменатите антитела се използва нормален заешки серум и допълнителна инкубация с вторично антитяло се извършва като отрицателна контрола. Тези тестове дадоха отрицателно оцветяване.

Съдържание на триглицериди в черния дроб и WAT.

Съдържанието на триглицериди (TG) в епидидимни WAT и чернодробни проби се определя с помощта на наличен в търговската мрежа комплект (Wako Chemicals).

Серумен TG, нива на свободна мастна киселина, общ холестерол, аланин трансаминаза и нива на адипонектин.

Концентрациите на серумен TG, свободна мастна киселина (FFA), общ холестерол (TC) и аланин трансаминаза (ALT) се определят с помощта на наличните в търговската мрежа комплекти (Wako Chemicals), а серумните нива на адипонектин се измерват с комплект адипонектин ELISA (Otsuka Pharmaceutical, Tokyo, Япония).

Тест за толерантност към глюкоза.

След едно нощно гладуване мишките се инжектират интраперитонеално с глюкоза (2,0 g/kg телесно тегло) и се вземат кръвни проби на 0, 15, 30, 60 и 120 минути. Концентрациите на глюкоза в кръвта се измерват с помощта на метода на глюкозната оксидаза и глюкозен анализатор (MS-GR101; Terumo, Токио, Япония). Концентрациите на серумен инсулин бяха определени с помощта на инсулинов комплект ELISA (Shibayagi, Gunma, Япония).

Измерване на V o 2 .

V o 2 се изчислява, като се използва система за индиректна калориметрия (Oxymax; Columbus Instruments, Columbus, OH). V o 2 и V co 2 са измерени по време на 24-часов период при стайна температура и нормализирани по телесно тегло. Дихателният коефициент (RQ) е съотношението на V co 2 към V o 2. Общият V o 2 и V co 2 се определят за период от 24 часа чрез интегриране на областите под кривите V o 2 и V co 2 (AUC V o 2 и AUC V co 2) съгласно трапецовидното правило. Изчислява се и AUC RQ.

Измерване на висцерални и подкожни мазнини.

Висцералните и подкожните мазнини бяха количествено определени чрез сканиране на абдоминална компютърна томография (CT) (RmCT; Rigaku, Токио, Япония). Сканирането на CT срезове беше получено в долния край на прешлен L4 с мишки в легнало положение, за да се измерват количествата на висцерални и подкожни мазнини на едно ниво. Определихме нивото на L4 прешлен като линията между двете най-високи точки на илиачния гребен. Изображенията са преобразувани във файлове, съвместими с търговската софтуерна програма i-Dixel-R (J. Morita Corporation, Киото, Япония).

Статистика.

МАСА 1

HF-индуцираното затлъстяване намалява серумните нива на IL-10, но не и на TNF-α, IL-1β или MCP-1