Резюме

Заден план

Хитозанът е обещаващ естествен източник за контрол на затлъстяването. Затлъстелите хора са склонни да използват допълнителни хранителни вещества, за да компенсират своите недостатъци в диетата си. Настоящото проучване има за цел да изследва комбинирания ефект на добавките с хитозан, калций и витамини А и Е срещу неблагоприятните ефекти от диетата с високо съдържание на мазнини при плъхове.

Методи

Двадесет и пет мъжки плъхове албиноси бяха разпределени в пет равни групи. Контролните плъхове са хранени със стандартна базална диета (SBD). Друга група е хранена с високомаслена диета (HFD) без добавки. Останалите три групи са били хранени с HFD, съдържащи 0, 400 и 800 mg хитозан на килограм диета, в присъствие на добавки с калций и витамини А и Е, всеки ден в продължение на 10 седмици.

Резултати

В сравнение с контролите, плъхове, хранени с HFD без добавки, показват значително повишаване на наддаването на телесно тегло, консумацията на храна, относителното тегло на сърцето и черния дроб, серумните нива на общия холестерол, триглицеридите, холестеролите на липопротеините с ниска плътност, уреята с много ниско съдържание на липопротеини, креатинин и малондиалдехид, както и серумна активност на аланин и аспартат аминотрансферази, алкална фосфатаза и креатин киназа. Освен това са регистрирани значителни спадове в относителното тегло на бъбреците, серумните нива на холестеролите на липопротеините с висока плътност, общите протеини, албумин, глобулин, калций, витамини А и Е, съдържание на еритроцитни глутатион и активност на супероксиддисмутаза. Хистопатологични промени са наблюдавани при плъхове, хранени с HFD със или без добавки. Напротив, плъхове, хранени с HFD, съдържащи хитозан и добавки, показват забележително подобрение във всички изследвани параметри спрямо контролните стойности, в зависимост от дозата.

Заключение

Хитозанът, калцийът и витамините А и Е намаляват неблагоприятните ефекти, причинени от приема на HFD при плъхове.

Заден план

Затлъстяването се счита за едно от най-големите предизвикателства, застрашаващи общественото здраве. Затлъстяването се произвежда главно от дисбаланс между въвеждането на калории и енергийните разходи (Delamater, Pulgaron и Daigre, 2013). Такъв дисбаланс води до необичайно натрупване на мазнини в немастните тъкани като мускулите, черния дроб, бъбреците и сърцето (Bahreini et al., 2013 и Snel et al., 2012). Диетата с високо съдържание на мазнини (HFD) допринася до голяма степен за разпространението на затлъстяването (Myles, 2014). Качеството на живот се влияе неблагоприятно от затлъстяването, тъй като е свързано с честотата на няколко разстройства като хипертония, диабет, остеоартрит и сърдечно-съдови заболявания (Boden, 2011). Поради това беше започнато по-голямо внимание на научната общност за решаване на този сериозен проблем. Няколко лекарства бяха одобрени за контрол на затлъстяването. Повечето от тези лекарства обаче имат неблагоприятни странични ефекти, скъпи и отнема много време, за да произведат своите ефекти (Mhurchu, Dunshea-Mooij, Bennett & Rodgers, 2005).

Хитозанът е естествен полизахарид, който се получава от хитин чрез N-деацетилиране (Anraku et al., 2018). В световен мащаб хитинът се счита за един от най-изобилните естествени неразтворими във вода полимери (Muxika, Etxabide, Uranga, Guerrero и De La Caba, 2017). Екзоскелетите на безгръбначните, особено ракообразните, представляват основните източници на хитин (Kumirska et al., 2010). Хитозанът има катионна природа, която улеснява проникването му през клетъчните мембрани (Cheung, Ng, Wong и Chan, 2015). Наскоро хитозанът участва в доставката на гени поради своята биосъвместимост (Choi, Nam и Nah, 2016). Хитозанът също има способността да ускорява зарастването на рани (Patrulea, Ostafe, Borchard и Йордания, 2015). Нещо повече, хитозанът се използва ефективно при управление на телесното тегло чрез отстраняване на липиди за по-нататъшно отделяне (Walsh, Sweeney, Bahar, & O’Doherty, 2013). Напоследък се съобщава, че хитозанът проявява антиоксидантни свойства както in vivo, така и in vitro (Anraku et al., 2011).

Калцият (Ca 2+) е предимно компонент в образуването на кости (Bonjour et al., 2014). В допълнение, Ca 2+ също медиира мускулна контракция, нервна сигнализация, вазодилатация и секреция на хормони (Nobre et al., 2011). Витамин А представлява жизненоважен микроелемент, който се съдържа главно в моркови, манго, черен дроб и яйца (Eastep & Chen, 2015). Витамин А и ретиноидите са отговорни за регулирането на растежа, възпроизводството и поддържането и възстановяването на епителната тъкан при бозайници (Eastep & Chen, 2015). Витамин Е е общ термин, който описва група мастноразтворими витамини (токофероли и токотриеноли) със забележителни антиоксидантни свойства (Niki & Traber, 2012). Витамин Е представлява основен компонент на ендогенната антиоксидантна система, която се получава главно от растителни масла (Rizvi et al., 2014). Високата липофилност на витамин Е позволява съхраняването му в мастната тъкан и следователно повишава неговата бионаличност (Zingg, 2007).

Затлъстелите хора обикновено са склонни да използват минерални и витаминни добавки, за да компенсират дефицита си в небалансираната диета. Доколкото ни е известно, проучванията за взаимодействието между хитозан и други добавки все още са редки (Rodrigues, Silva и Lacerda, 2012). Съответно, настоящата работа е предназначена да изследва потенциалните комбинирани ефекти на добавките с хитозан, калций и витамини А и Е срещу неблагоприятните ефекти, предизвикани от консумацията на HFD при плъхове.

Методи

Експериментална диета

В настоящото проучване са приложени два вида диети. Първият тип беше стандартната базална диета (SBD), която беше приготвена съгласно метода, описан от Reeves, Nielsen и Fahey Jr (1993). Втората диета е диетата с високо съдържание на мазнини (HFD), която се приготвя чрез модифициране на SBD чрез увеличаване на количеството липиди, като същевременно намалява съдържанието на въглехидрати (Chien, Ku, Chang, Yang и Chen, 2016). Химичният състав на двете диети е представен в таблица 1.

Добавки

Хитозан с високо молекулно тегло (310 000–375 000 Da), витамин А (ретинил палмитат) и витамин Е (DL-α-токоферол ацетат) са получени от химическата компания Sigma-Aldrich, САЩ. Калцият (Ca 2+) е закупен под формата на калциев карбонат от фармацевтичната химическа компания El Nasr, Египет. Количествата на витамин А, калций и витамин Е се допълват според Mahassni и Al-Shaikh (2013), Nobre et al. (2011) и Shen, Tang, Huang и Cai (2010), съответно.

Животни

Възрастни здрави мъжки плъхове Sprague Dawley, с тегло 100 ± 10 g, са закупени от VACERA vivarium, Helwan, Египет. Плъховете са настанени в къща за животни на Националния институт по хранене (NNI), Кайро, Египет и са поддържани на стандартна диета и чешмяна вода в продължение на 1 седмица, за да се аклиматизират, преди да започнат експериментите.

Уча дизайн

Двадесет и пет мъжки плъхове бяха разделени на пет групи (5 плъха/група), както е показано в таблица 2.

Вземане на проби

В края на експеримента плъхове се гладуват в продължение на 12 часа, след което се умъртвяват под анестезия, като се използва натриев пентобарбитал. Кръвни проби бяха събрани от вагусната вена и разделени на две части. Първата част се събира в сухи епруветки и се оставя да престои, след което се центрофугира при 3000 rpm в продължение на 15 минути, за да се отдели серумът. Бистрият серум се съхранява във фризера при - 20 ° C за последващ биохимичен анализ. Втората част се събира върху EDTA и след това се центрофугира при 1000 ×ж за 10 минути при 40 ° С. Получената плазма и белият слой на буфа се изхвърлят. Останалите еритроцити се лизират в ледено студена HPLC вода и след това се центрофугират при 10000 ×ж за 15 минути при 4 ° С. Супернатантът на еритроцитния лизат се събира и съхранява във фризер дълбоко при - 80 ° C. Дисекцията е извършена веднага след скарифициране за извличане на сърцето, бъбреците и черния дроб. Екстрахираните органи се смилат във физиологичен разтвор (0.9%) и след това се сушат с помощта на филтърни хартии и се претеглят веднага.

Биологични параметри

Количеството храна, консумирана от всяка група, се определя всяка седмица по време на експериментите и след това се разделя на броя на животните в група, за да се изчисли средната консумация на храна. Началното и крайното тегло на всички експериментални плъхове бяха измерени, за да се изчисли наддаването на телесно тегло (BWG), след получаване на диети. Относителните тегла на сърцето, бъбреците и черния дроб на всички експериментални групи бяха оценени в края на експериментите.

Биохимичен анализ

Определяне на серумния липиден профил

Нивата на серумния общ холестерол (TC), триглицеридите (TG) и липопротеиновите холестероли с висока и ниска плътност (HDL-C и LDL-C) бяха анализирани с помощта на Analyticon Biotechnologies kit, Германия, съгласно техниките, определени от Allain, Poon, Chan, Richmond и Fu (1974), Nauck et al. (1997), Sullivan, Kruijswijk, West, Kohlmeier и Katan (1985) и Wieland и Seidel (1983), съответно. Нивата на много ниско-липопротеинови триглицериди (VLDL-TG) са изчислени съгласно формулата на Friedewald: VLDL-TG = TG/5.

Определяне на профила на серумен протеин

Нивата на общите протеини (TP) и албумин са оценени според брошурата на ELiTech kit, Франция, съгласно методите, описани съответно от Bartholomew и Delaney (1964) и Doumas (1975). Нивата на глобулин и съотношение албумин/глобулин са изчислени, както е описано от Cui et al. (2015).

Определяне на активността на серумните аминотрансферази

Дейностите на серумните аланин и аспартат аминотрансферази (ALAT и ASAT) се определят съгласно метода, посочен от Schumann et al. (2002a, 2002b), използвайки комплекти, получени от лабораторията Stanbio, САЩ.

Определяне на активността на серумната алкална фосфатаза

Алкалната фосфатаза в серума (ALP) се определя съгласно ръководството на комплекта от Biosystem, Испания. Методът е описан от Tietz, Rinker и Shaw (1983).

Определяне на активността на серумна креатин киназа

Активността на креатин киназата (CK) е анализирана, както е описано от Burtis, Ashwood и Bruns (2012), използвайки комплекти Spectrum (Кайро, Египет).

Определяне на серумните нива на креатинин и урея

Нивото на серумен креатинин беше определено съгласно ръчните инструкции на комплекта от BioMed, Египет (Toora & Rajagopal, 2002). Серумната урея се определя в съответствие с ръчните инструкции на комплекта от Diamond, Египет (Tabacco, Meiattini, Moda и Tarli, 1979).

Определяне на нивата на общия калций в серума

Серумните нива на теста за определяне на калция са извършени според Kessler и Wolfman (1964), като се използват комплекти Spectrum (Кайро, Египет).

Определяне на серумните концентрации на витамини А и Е

Нивата на витамини А и Е се определят в серума на плъхове с помощта на високоефективна течна хроматография (HPLC). Методът за определяне е съгласно Bieri, Tolliver и Catignani (1979).

Определяне на биомаркер за пероксидация на липиди и ендогенни антиоксиданти

Серумните нива на малоновия диалдехид (MDA) се определят като биомаркер за липидна пероксидация (LPO) съгласно метода, описан от Uchiyama и Mihara (1978). Нивото на глутатион (GSH) и активността на супероксиддисмутазата (SOD) са открити в еритроцитите, както е посочено от Beutler (1963) и Winterbourn, Hawkins, Brian и Carrell (1975), съответно. Серумните нива на MDA, както и съдържанието на GSH в еритроцитите и активността на SOD бяха оценени с помощта на биодиагностични комплекти (Гиза, Египет).

Хистологично изследване

Малки части от сърцето, бъбреците и черния дроб бяха фиксирани в 10% формалин за хистологично изследване. Фиксираните тъкани се обработват за приготвяне на парафинови срезове с дебелина 5 μm. След това тези секции бяха оцветени с хематоксилин и еозин, както е описано от Suvarna, Layton и Bancroft (2018).

Статистически анализ

Настоящите данни бяха статистически анализирани с помощта на Статистически пакет за социалните науки (SPSS) версия 22. Тестовете на Колмогоров-Смирнов разкриха, че данните са нормално разпределени, т.е. променливите са параметрични (Razali & Wah, 2011). Post hoc тестът на Дънкан беше използван, за да покаже сходство във всички изследвани параметри сред експерименталните групи. Коефициентът на корелация на Пиърсън е приложен за корелация на изследваните параметри с количеството хитозан в диетата.

Резултати

Ефект върху биологичните параметри

BWG, консумацията на фураж и относителното тегло на сърцето, бъбреците и черния дроб на всички експериментални плъхове, след 10 седмици след получаване на подходящи диети, са показани в Таблица 3. При плъхове от групи II, III и IV, BWG и консумацията на фуражи са значително по-високи, отколкото в група I. Плъховете от група IV показват забележително намаляване на BWG и приема на фураж, в сравнение с групи II и III, но са значително по-високи, отколкото в група V. При плъхове от групи III, IV и V, количеството хитозан е в отрицателна корелация с BWG и консумацията на фураж. Плъховете от групи II и III показват забележимо намаляване на относителното тегло на бъбреците, но забележително повишаване на относителното тегло на сърцето и черния дроб в сравнение с другите групи. Относителното чернодробно тегло на група IV е значително по-високо, отколкото в група I.

Ефект върху липидния профил в серума

В таблица 4 са регистрирани нивата на TC, TG, HDL-C, LDL-C и VLDL-TG в серума на всички експериментални групи. Плъхове от групи II и III показват значително повишаване на серумните нива на TC, TG, LDL-C и VLDL-TG, докато забележителен спад в нивата на HDL-C в сравнение с група I. В сравнение с групи II и III, плъхове от групи IV и V показват значително намаляване на серумните нива на TC, TG, LDL-C и VLDL-TG, докато забележително повишаване на нивата на HDL-C към контролните стойности.

Ефект върху протеиновия профил в серума

Концентрациите на TP, албумин, глобулин и съотношение албумин/глобулин на всички групи са изяснени в Таблица 5. При плъхове от групи II и III серумните нива на повечето белтъчни променливи са значително по-ниски, отколкото в групи I, IV и V. Чрез увеличаване на количеството хитозан в добавки, съдържащи HFD, серумните нива на всички протеинови променливи са значително повишени до нормалните стойности на контролите.

Ефект върху активността на аминотрансферазите, алкалната фосфатаза и креатин киназата, както и нивата на креатинин и урея в серума

Таблица 6 показва серумните активности на ALAT, ASAT, ALP и CK, както и серумните нива на креатинин и урея на всички плъхове. Плъхове от групи II, III, IV и V показват значително повишаване на серумните активности на ALAT, ASAT и ALP в сравнение с група I. Серумните активности на ALAT, ASAT и ALP от група IV са значително по-високи, отколкото в група V, докато забележително по-ниски, отколкото в групи II и III. Сред всички експериментални групи серумната активност на CK и серумните нива на креатинин и урея са сходни, с изключение на значително повишение в групи II и III.

Ефект върху серумните нива на калций и витамини А и Е

Серумните нива на калций и витамини А и Е от всички групи са показани в Таблица 7. При плъхове от група II серумните нива на калций и витамини А и Е са значително изчерпани в сравнение с останалите групи. Група III показва значително повишаване на серумните нива на калций и витамини А и Е в сравнение с останалите групи. При плъхове от група IV серумните нива на калций и витамини А и Е са значително по-високи, отколкото при група V. Плъховете от групи IV и V разкриват забележително повишаване на нивата на витамини А и Е в серума, в сравнение с групи I и II.

Ефект върху серумните нива на съдържание на малондиалдехид и еритроцити глутатион и активност на супероксиддисмутаза

Серумното ниво на MDA, както и съдържанието на GSH в еритроцитите и активността на SOD във всички групи са показани в Таблица 7. При плъхове от групи II и III се съобщава за значително повишаване на нивата на MDA в серума във връзка с значително намаляване на съдържанието на GSH и активността на SOD, в сравнение с групи I, IV и V. Плъхове от групи IV и V показват подчертан спад в нивата на MDA в серума, с нарастващо съдържание на хитозан в HFD. В допълнение, нивата на GSH и активността на SOD от групи IV и V бяха върнати към нормалните нива от група I.

Хистологични изследвания

В настоящото проучване не са наблюдавани очевидни лезии в сърцето и бъбречните тъкани на всички групи, с изключение на конгестия на миокарден кръвоносен съд (фиг. 1) и некроза на епителната лигавица на бъбречни тубули (фиг. 2) от групи II и III. На фиг. 3 чернодробните тъкани от групи II, III и IV показват натрупване на мазнини (стеатоза) в хепатоцитите. В чернодробната тъкан от група V не са открити изразени лезии с изключение на лека вакуолация.

мелиоративна

Хистологично изследване на сърдечната тъкан на всички опитни плъхове, в края на експериментите. I: Контролни плъхове, II: плъхове, хранени с HFD без добавки, III: плъхове, хранени с HFD + добавки, IV: плъхове, хранени с HFD + добавки + 400 mg хитозан и V: плъхове, хранени с HFD + добавки + 800 mg хитозан. BVC: задръстване на кръвоносни съдове, MF: миокардно влакно и N: ядро. Хематоксилин и еозин, X200

Хистологично изследване на бъбречната тъкан на всички опитни плъхове, в края на експериментите. I: Контролни плъхове, II: плъхове, хранени с HFD без добавки, III: плъхове, хранени с HFD + добавки, IV: плъхове, хранени с HFD + добавки + 400 mg хитозан и V: плъхове, хранени с HFD + добавки + 800 mg хитозан. ELN: Некроза на епителната лигавица на бъбречните тубули, Gl: гломерул и RT: бъбречни тубули. Хематоксилин и еозин, X200

Хистологично изследване на чернодробната тъкан на всички експериментални плъхове, в края на експериментите. I: Контролни плъхове, II: плъхове, хранени с HFD без добавки, III: плъхове, хранени с HFD + добавки, IV: плъхове, хранени с HFD + добавки + 400 mg хитозан и V: плъхове, хранени с HFD + добавки + 800 mg хитозан. CV: централна вена, H: хепатоцит, S: стеатоза (натрупване на мазнини) и SV: лека вакуолация. Хематоксилин и еозин, X 200

Дискусия

Заключение

При плъхове, хранени с HFD без добавки, са регистрирани значителни промени във всички изследвани биологични, биохимични параметри и хистологични изследвания. Чрез включване на добавки с HFD без хитозан се забелязват значителни нарушения в повечето от изследваните променливи, но се забелязват забележителни повишения в серумните нива на калций и витамини А и Е. Чрез увеличаване на количеството хитозан в добавки, съдържащи HFD, се отчитат съществени облекчения на всички изследвани параметри, в зависимост от дозата.