РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

Затлъстяването е основен рисков фактор за остеоартрит на коляното (ОА) (Deshpande et al., 2016; Felson et al., 1988), удвоявайки риска през целия живот в сравнение с индивидите с индекс на телесна маса (BMI) под 25 (Murphy et al., 2008). Смята се, че биомеханичните, възпалителни и метаболитни фактори допринасят за свързаната със затлъстяването патология на ОА (Courties et al., 2015; Issa and Griffin, 2012; Messier, 2009; Rai and Sandell, 2011; Thijssen et al., 2015). Освен това много проучвания показват, че компонентите на метаболитния синдром, включително хипертония, хипергликемия, дислипидемия и централно затлъстяване, са свързани с патологията на ОА и риска от прогресия (Berenbaum et al., 2017; Katz et al., 2010; Sowers et al ., 2009; Zhuo et al., 2012). По-специално, ставният хрущял е податлив на вредните ефекти както на повишената глюкоза, така и на липидите. Например, високата диетична консумация на мазнини (Lu et al., 2016) и диабет тип 2 (Eymard et al., 2015) са свързани с по-бързо прогресиращо стесняване на ставното пространство при лица с ОА на коляното, дори след корекция за ИТМ. Причинната роля на метаболитния синдром и неговите компоненти в прогресията на ОА на коляното обаче остават неясни (Appleton et al., 2017; Niu et al., 2017). По този начин, експерименталното изолиране на ефектите на специфични хранителни макронутриенти върху метаболизма на хрущяла и патологията на ставите може да подобри нашето разбиране за това как метаболитните фактори допринасят за OA патогенезата.

независими

Използването на индуцирани от диетата модели на затлъстели животни за изследване на патогенезата на ОА се разширява бързо през последните 10 години (Berenbaum et al., 2017; Griffin and Guilak, 2008). Въпреки това, променливостта във времето и тежестта на индуцираните с диета с високо съдържание на мазнини фенотипове на ОА, особено при мишки, повдига въпроси относно стабилността и повторяемостта на модела (Kozijn et al., 2017). Един потенциален източник на вариации е сравнението на дефинирани диети с високо съдържание на мазнини и недефинирани диети с чау, които се различават по много начини, различни от само съдържанието на мазнини (Warden and Fisler, 2008). Например, диетите с чау съдържат високи нива на изофлавони, които могат да повлияят на хормонозависимите фенотипове на гризачи (Brown and Setchell, 2001). Друга разлика между чау и дефинираните диети е тип и съдържание на фибри. Дефинираните диети често включват неразтворими фибри, целулоза, което допринася за промени в морфологията на червата и съдържанието на микробиота (Chassaing et al., 2015; Dalby et al., 2017). Освен това, дори когато се използват дефинирани контроли и диети с високо съдържание на мазнини, специфичният състав на макронутриентите може да варира и да допринася за метаболитни смущения. Wu и колеги показаха елегантно значението на диетичния състав на мастните киселини в посттравматичната OA патогенеза (Wu et al., 2015).

Сравнихме независимите ефекти на диетата захароза и мазнини върху патологията на ОА на коляното и метаболизма на хрущяла чрез хранене на мишки C57BL/6J с една от трите дефинирани диети: (1) Диета с 10% ккал мазнини със съдържание на захароза, съответстваща на диетата с високо съдържание на мазнини (7%), тук дефиниран като нискомаслена ниско захароза (LFLS); (2) използваната преди това диета с 10% ккал мазнини с по-високо съдържание на захароза (35%), наричана нискомаслена с висока захароза (LFHS); и (3) използваната преди това диета с високо съдържание на мазнини, съдържаща 60% kcal мазнини и 7% kcal захароза, посочена като ниско захароза с високо съдържание на мазнини (HFLS) (Таблица S1). Определенията на диетичните групи като LFLS, LFHS и HFLS имат за цел да разграничат относителното съдържание на захароза и мазнини между групите, въпреки че групата LFLS е подобна на диетата с чау по отношение на захароза и съдържание на мазнини. Ние предположихме, че повишените диетични захароза и мазнини (т.е. LFHS и HFLS диети, съответно) биха индуцирали системна метаболитна патология, хрущялен стрес и маркери на ранен стадий на OA патология в сравнение с диетичната група LFLS. Ние се фокусирахме върху 20-седмично диетично лечение, което причинява ранен стадий на ОА патология в групата на HFLS (Barboza et al., 2017).

РЕЗУЛТАТИ

Диетичното съдържание на захароза в диети с ниско съдържание на мазнини променя метаболитните биомаркери в серума, без да променя телесното тегло или мазнините

Високото съдържание на захар в диетата не променя телесното тегло или процентното съдържание на телесни мазнини при мишки, хранени с диети с ниско съдържание на мазнини (т.е. 10% kcal мазнини, 70% kcal въглехидрати) (Фиг. 1A, B, LFLS спрямо LFHS). За разлика от това, мишките, хранени с диета с HFLS, са натрупали значително повече телесно тегло (∼40% увеличение) и телесни мазнини (∼2,5-кратно увеличение) в сравнение с мишки, хранени с ниско съдържание на мазнини, независимо от съдържанието на захароза (Фиг. 1А, В). За да характеризираме допълнително метаболитните ефекти на хранителната захароза и съдържанието на мазнини, ние също анализирахме панел от диагностични серумни метаболитни маркери в кръвта, събрани по време на смъртта. При аутопсия наблюдавахме тумороподобни възли в черния дроб на две LFLS животни. Наличието на възли е свързано с променени серумни метаболити и синовиално удебеляване (фиг. S1); поради това тези проби бяха изключени от окончателния серумен и синовиален анализ, както и от генетичния и протеиновия анализ на хрущяла. Ние обаче не наблюдаваме разлики в резултатите по хистопатология на хрущялите или остеофитите, свързани с възлите на черния дроб, така че тези проби бяха включени в тези анализи на резултатите.

Корелационен мрежов анализ на метаболитните ензими на метаболизма на хрущяла и антиоксидантната реакция на стрес след диети с високо съдържание на захароза и мазнини. Мрежите бяха разработени въз основа на значително корелирани протеинови двойки (т.е. коефициент на корелация | r | ≥0,8, P≤0,05) сред независими диетични хрущялни проби, анализирани чрез SRM масспектрометрия. (A) Графично представяне в мрежа за всяка диета. Квадратите представляват един протеин (т.е. „възел“) с поне една значима корелация (т.е. „връзка“) с друг протеин. Ензимните функционални категории и посоката на корелация се обозначават с бутона. (Б) Изчисленията на плътността на мрежата показват значителни диетични ефекти, като най-големи са при диета с високо съдържание на захароза и най-малко при диета с високо съдържание на мазнини. (C) Диаграмата на Venn на корелираните ензимни двойки показва, че повечето корелации са специфични за диетата. (D) Мрежови плътности, присъщи на специфични метаболитни пътища. Метаболизмът на въглехидратите и плътността на цикъла на TCA са повишени за диети с LFLS и LFHS, докато плътността на метаболизма на мастните киселини е относително най-голяма при диета с HFLS. (E) Специално за диетата сравнение на протеини с най-голям брой връзки с други протеини (т.е. протеини на „концентратор“) Пълните имена на протеини са налични в таблица S4.

ДИСКУСИЯ

Ние предположихме, че повишената хранителна захароза и мазнини ще индуцират системна метаболитна патология, хрущялен стрес и маркери в ранен стадий на OA патология в сравнение с диетичната група LFLS. Нашите открития показват широки ефекти от диетата захароза и мазнини във всички тези резултати, както е обобщено в Таблица 1. По-специално, най-голям брой промени са настъпили между диетите с ниско и високо съдържание на захароза, въпреки че няма разлики в телесната маса или телесните мазнини. Например имаше повече от два пъти повече разлики в експресията на хрущялния ген и изобилието на протеини между диетите с ниско и високо съдържание на захароза в сравнение с диетите с ниско и високо съдържание на мазнини (Таблица 1). Въпреки това, противно на нашата хипотеза, повече патологични промени са свързани с диета с ниско съдържание на захароза. Например, патологията на хрущяла и биомаркерите на серумната метаболитна болест са намалени в групата с високо съдържание на захароза (Таблица 1). Следователно, за проучвания, използващи диети с високо съдържание на мазнини за изследване на индуцирана от затлъстяването ОА, въглехидратният състав на диетата с ниско съдържание на мазнини има потенциал да промени значително интерпретацията на резултатите, свързани със затлъстяването (напр. Сравнете „Повишените мазнини“ и „Смесените сравнение 'резюмета на колони в таблица 1).

Обобщение на резултатите за всички сравнения, специфични за диетата

Важността на състава на контролните диети в проучванията за затлъстяване, предизвикани от диета с високо съдържание на мазнини, по патофизиология на ОА не е била призната по-рано. Всъщност наскоро прегледахме как варирането в съдържанието и състава на диетите с високо съдържание на мазнини е потенциална причина за разликите в резултатите от ОА (Berenbaum et al., 2017). Въпреки това, въз основа на настоящите ни констатации, вариациите в диетите за контрол също могат да бъдат допринасящ фактор. Ние съставихме продължение на Таблица 2 на Berenbaum et al. (2017), който включва контролните диети, използвани в проучвания на диета, индуцирано затлъстяване и ОА (Таблица S5). Тази таблица показва, че подобно на вариациите в диетите с високо съдържание на мазнини, също има значителни вариации между диетите за контрол, включително използването на непречистени диети „чау“ спрямо диети с ниско съдържание на мазнини. Тази добавена вариация в състава на контролната диета може допълнително да допринесе за разликите, съобщени в литературата (Kozijn et al., 2017).

Нашите открития хвърлят светлина върху важен въпрос в тази област, който е до каква степен промените в системния метаболизъм променят метаболизма на ставните тъкани? По отношение на системните фактори, ние забелязахме, че повишените нива на общия серумен протеин и уреен азот, фактори, потенциално свързани с повишен протеинов катаболизъм или бъбречно или чернодробно заболяване, са свързани с намалено оцветяване на хрущяла Safranin-O при мишки, хранени с LFLS. Нискостепенното системно възпаление и хипертонията са клинично свързани с прогресията на ОА (Attur et al., 2015; Niu et al., 2017), въпреки че не са тествани в настоящото проучване. При мишките, хранени с HFLS, повишеният холестерол е свързан с повишено дублиране на хрущял на tidemark и образуване на остеофити. По-рано е доказано, че високият холестерол увеличава ектопичното костно образуване в експериментални проучвания на мишки (de Munter et al., 2013), а нерегулираните нива на холестерол и повишените хранителни мазнини са свързани с ОА при хората (Berenbaum et al., 2017; Clockaerts et ал., 2011; Lu et al., 2016).

Това проучване има няколко ограничения. Открихме, че многобройни гени и протеини, свързани със стреса, са били повишени в хрущяла от групата на LFLS. С нашия дизайн на проучването обаче не е възможно да се интерпретира дали генната експресия е повишена в групата на LFLS или потисната в групите LFHS и HFLS без данни от по-ранни точки, за да се установи основно ниво на експресия. Интерпретацията също е възпрепятствана от функционална гледна точка, тъй като реагиращите на стрес гени често първоначално се регулират в хомеостатичен отговор. Тези ограничения важат и за интерпретацията на мрежовите анализи. Необходими са бъдещи надлъжни проучвания, за да се установи причинно-следствената връзка на тези диетични лечения.

Допълнително ограничение е, че диетичните лечения се различават в относителния период от време, в който животните са настанени в лабораторията Джаксън спрямо Фондацията за медицински изследвания в Оклахома (OMRF). Животните от LFHS и HFLS започнаха диетично лечение на 6-седмична възраст в услугата на затлъстелите мишки, предизвикана от диета на лабораторията Джаксън, преди да бъдат закупени на възраст 23-24 седмици. Следователно тези животни бяха настанени в OMRF само до 3 седмици преди събирането на тъкани. За разлика от тях, диетата LFLS не се предлага чрез услугата на лабораторията Джаксън, предизвикана от диета, затлъстяла мишка. Следователно животни са закупени от лабораторията Джаксън на 5-седмична възраст и са хранени с диетата LFLS в OMRF на възраст от 6 до 26 седмици. Опитахме се обаче да сведем до минимум други потенциални източници на вариации чрез оценка на съвместната хистопатология по заслепен начин за всички групи едновременно. Също така проведохме всички анализи на серумна и генна експресия за всички групи едновременно и протеомните анализи бяха завършени в две партиди, които включваха проби от смесени диетични групи.

Заключения

Затлъстяването е основен рисков фактор за ОА на коляното, но как пробезогенните диети и техните различни компоненти на макроелементи влияят на патофизиологията на хондроцитите не е добре разбрано. Резултатите от това проучване показват, че съдържанието на захароза и мазнини в диетата имат независими ефекти върху серумните метаболитни биомаркери и патофизиологията на колянната става, включително значителни промени в хрущялните метаболитни и чувствителни на стрес гени и протеини. Относителното съдържание на захароза спрямо царевично нишесте в нискокалорични пречистени диети причинява значителни разлики в серумните метаболити, патологията на ставите и метаболизма на хрущялите и реакцията на стрес, въпреки липсата на разлики в телесната маса или телесните мазнини. Тези резултати илюстрират въздействието на метаболитните фактори върху OA патофизиологията, независимо от промените в затлъстяването. Констатациите също така показват, че изборът на контролни диети в проучвания за затлъстяване, предизвикани от диета при мишки, трябва да бъде внимателно обмислен при планирането на проучването и интерпретацията на резултатите. И накрая, нашите открития показват, че повишените хранителни мазнини предизвикват метаболитна промяна в метаболизма на хрущяла към повишено използване на мастни киселини. По този начин промененият метаболизъм на хрущяла може да бъде фактор, допринасящ за това как затлъстяването увеличава риска от ОА.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Животни

Анализ на серумен метаболит

Животните бяха поставени в транспортни клетки и преместени в лабораторията за период от 1-2 часа преди вземането на кръв между 09:00 и 11:00. Взехме кръв като крайна процедура чрез сърдечна пункция под изофлуранова анестезия. Кръвта се оставя да се съсирва в епруветки с микровети (CB 300 Z, SARSTEDT, Германия) при стайна температура за 20 минути и след това се центрофугира при 10 000 ж за 5 минути. Серумът се разделя на аликвотни части и се замразява при -80 ° С до анализ. Серумните метаболити се измерват в проби с ≥200 µl серум, като се използва IDEXX Catalyst Dx Chemistry Analyzer (САЩ) с Chem 17, триглицериди и фруктозамин панели, следвайки инструкциите на производителя.

Хистопатологичен анализ

След смъртта, левият крайник е обелен и коляното е изолирано чрез ръчна дисекция от средната бедрена кост до средната пищяла. Периартикуларният скелетен мускул е задържан, за да улесни фиксирането под физиологичен ъгъл на ставата и е направен малък разрез близо до началото на пателарната връзка, за да се разкрие ставната кухина. След това ставите се поставят в 4% параформалдехид за 24 часа при 4 ° С за фиксиране на тъканите. След фиксирането периартикуларните мускули бяха премахнати чрез груба дисекция, коленете бяха изплакнати с фосфатно буфериран физиологичен разтвор и ставите бяха декалцифицирани с помощта на разтвор за декалциране на база CalEx HCl (Thermo Fisher Scientific, САЩ) за 3 дни при 4 ° C. След това колената се дехидратират в етанолов градиент преди влагане на парафин и сагитално секциониране. Слайдовете бяха оцветени с хематоксилин, Fast Green и Safranin-O за хистологично класиране, както е описано по-горе (Cai et al., 2014; Griffin et al., 2010).

Екстракция на РНК и протеини

Анализ на генната експресия чрез количествена PCR реверсивна транскрипция

Проектирахме персонализирани количествени PCR масиви (Qiagen, САЩ), съдържащи 42 целеви гена, свързани с патологията на ОА, клетъчния метаболизъм и клетъчния стрес (Таблица S3). Масивът включва три референтни гена (B2m, Gapdh и Actb), положителна PCR контрола, положителна контрола на обратната транскрипция и отрицателна геномна ДНК контрола. След това 200 ng cDNA бяха синтезирани с помощта на RT 2 First-Strand kit (Qiagen) и заредени върху плаки, следвайки инструкциите на производителя. Плаките се пускат на CFX96 термоциклер (Bio-Rad, САЩ). Данните за всеки целеви ген бяха нормализирани спрямо средната геометрична стойност на трите референтни гена и генната експресия беше оценена с помощта на метода 2-ΔCt (Schmittgen and Livak, 2008).

Анализ на изобилие на протеини чрез SRM масспектрометрия

Анализ на протеинова корелационна мрежа

Изграждането и анализът на протеиновата корелационна мрежа е извършен, както е описано по-рано (Batushansky et al., 2016). Накратко, специфичните за диетата матрици на корелация на Пиърсън бяха изчислени за всички проби от всяка диета (n = 8 на диета), използвайки психическия пакет за R-софтуер (https://CRAN.R-project.org/package=psych). Избран е висок праг за коефициент на корелация | r | ≥0,8, P≤0,05 въз основа на ефектите от размера на извадката върху стабилността на основните свойства на теорията на графика на мрежата, като транзитивност, плътност и диаметър (Pavlopoulos et al., 2011). Значителните корелационни матрици бяха трансформирани в съседни списъци и визуализирани в Cytoscape, версия 3.5.1 (Shannon et al., 2003). Изчисляването на мрежовите свойства беше извършено с помощта на igraph пакет за R-софтуер (Csardi and Nepusz, 2006).

Статистически анализ