Субекти

Резюме

Съобщаваме за неочаквана връзка между стареенето, термогенезата и наддаването на тегло чрез рецептора, свързан с протеин G протеин GPR3. Мишките, които нямат GPR3 ​​и се поддържат в нормален чау, са имали сходни телесни тегла през първите 5 месеца от живота си, но след това са натрупали значително повече тегло и са показали намален общ енергиен разход и по-ниска основна телесна температура. Към 5-месечна възраст GPR3 ​​KO мишките вече са имали по-ниска термогенна генна експресия и ниво на разединяване на протеин 1 и показват нарушено усвояване на глюкоза в междускапуларната кафява мастна тъкан (iBAT) спрямо WT котилата. Тези молекулярни отклонения в iBAT на GPR3 ​​KO мишки предшестват измерими разлики в телесното тегло и основната телесна температура при условия на околната среда, но са свързани с неуспех да се поддържа термична хомеостаза по време на остра студена атака. В същото време същото студено предизвикателство предизвика 17-кратно увеличение на експресията на Gpr3 в iBAT на WT мишки. По този начин GPR3 ​​изглежда има ключова роля в термогенния отговор на iBAT и може да представлява нова терапевтична цел при свързаното с възрастта затлъстяване.

Въведение

Затлъстяването представлява голяма глобална тежест за здравеопазването, която вече не се ограничава до развитите страни. Неотдавнашен доклад изчислява, че почти една трета от младите и възрастните в цял свят са с наднормено тегло или затлъстяване 1 и тази част се очаква да продължи да нараства в резултат на застаряващото общество 2,3,4,5,6. До 2050 г. броят на възрастните в САЩ на възраст 65 и повече години се очаква да се удвои от 40,2 милиона на 88,5 милиона 7 .

Въпреки цялостния забележителен напредък в разбирането на биоенергийните пътища, въпросът защо стареенето предразполага към наддаване на тегло остава неадекватно разгледан. Наблюдавано е затлъстяване при възрастни или късно настъпване при мишки, при които липсва активационен фактор 8 на тромбоцитите, тип 3 аденилил циклаза 9, инсулинов рецептор в кафява мастна тъкан 10, при трансгенни мишки с ген на човешки ренинов ген или е експериментално индуциран при овариектомизирани млади женски плъхове 12 . Нарастването на теглото, свързано с възрастта, постоянно се асоциира с нарушена термогенеза поради програмирана загуба на функция на междускапуларната кафява мастна тъкан (iBAT) 8,13,14, която премества излишната енергия към висцерални и подкожни мастни депа за съхранение . И все пак зависимите от възрастта фактори, контролиращи функцията на iBAT, остават до голяма степен неизвестни.

GPR3 е сирак от клас А на суперсемейството на G протеин-свързан рецептор (GPCR), хомолог на клъстера, който включва GPR6 и GPR12, чиито естествени лиганди все още са неизвестни 16,17,18,19,20. Синтетична малка молекула наскоро беше идентифицирана като специфичен сурогатен агонист на човешки GPR3 ​​21,22. GPR3 е силно експресиран в ооцити, където е свързан с поддържане на мейотичен арест на ооцити 23,24,25,26,27,28,29,30 и яйчникова недостатъчност 31,32,33. GPR3 също се изразява силно в мозъчните области, замесени в невродегенеративни заболявания 34,35. Възможната роля на GPR3 ​​в метаболитните и стареещите ефекти, особено по отношение на наддаването на тегло, не е проучена. Нашият интерес към GPR3 ​​първоначално беше обусловен от неговата хомология на последователността с два съществуващи канабиноидни рецептора 36, което го направи потенциален кандидат в нашето търсене на все още неидентифициран трети канабиноиден рецептор. Бяхме изненадани обаче да открием нов и неочакван фенотип, който даде нова посока на нашето изследване. Тук съобщаваме за неочаквана връзка между стареенето и затлъстяването чрез GPR3. Мишките, които нямат GPR3, показват затлъстяване с късно начало, свързано с намаляване на нивото на отделяне на протеин 1 в iBAT и термогенезата.

Резултати

По-старите мишки Gpr3 KO имат затлъстял фенотип

Gpr3 се изразява в няколко метаболитно активни периферни тъкани, макар и на по-ниски нива от тези в централната нервна система (ЦНС) (фиг. 1А) и неговата частична или пълна делеция води до специфични за генотипа промени в телесното тегло на по-възрастните (12-месечни ) мишки (фиг. 1В). По този начин, в продължение на една година, GPR3 ​​хетерозиготни (Het) и нокаутиращи (KO) мишки, поддържани на редовна миша чау, печелят средно

30% по-голямо тегло, съответно, от техните съотборници на диви видове (WT) и визуално се различават един от друг (фиг. 1Б). Разликите в телесното тегло сред 12-месечните жени на GPR3 ​​WT, Het и KO също са значителни, но по-малко забележими, отколкото при мъжете (съответно 27,31 ± 1,14 g, 27,39 ± 0,83 g и 30,93 ± 1,04 g; P Фигура 1

нямат

Фенотипни разлики сред GPR3 ​​мишки.

Индексите на затлъстяване при по-стари GPR3 ​​Het и KO мъжки мишки са се увеличили съответно 1,7 ± 0,3 пъти и 2,0 ± 0,1 пъти, в сравнение с WT котилата (фиг. 1С). Най-забележимите разлики са наблюдавани в подкожни (фиг. 1D) и епидидимни (фиг. 1Е) мастни депа, които представляват по-голямата част от затлъстяването и наддаването на тегло. В съгласие с появата на хистологични разрези, подкожните и епидидималните адипоцити са забележимо по-големи при 12-месечни мишки GPR3 ​​KO, отколкото при съпоставени с възрастта WT кученца (фиг. 1С). Оцветяването на хематоксилин и еозин (H&E) на чернодробни секции от по-стари мишки GPR3 ​​KO разкрива натрупване на мастни капчици, което е успоредно със значително увеличение на съдържанието на чернодробни триглицериди (фиг. 1С). Изненадващо, изтриването на GPR3 ​​няма ефект върху серумните метаболитни маркери при 12-месечни мишки на гладно. Едно забележително изключение беше лептинът, чиято висока концентрация в GPR3 ​​KO мишки директно корелира с повишеното им затлъстяване (Таблица 1). Също така, след гладуване през нощта, концентрацията на базална глюкоза в кръвта при по-възрастни мишки GPR3 ​​KO е била значително по-висока, отколкото при техните сънародници в WT, а GPR3 ​​KO показва значително увреждане на техния глюкозен толеранс (GTT; Фиг. 1G, ляв панел), както е отразено от по-висок Стойност на AUC, отколкото при аналозите на WT (съответно 353,63 ± 34,02 и 248,02 ± 11,64 часа x mg/dL, P Таблица 1 Серумни метаболитни маркери и концентрация на глюкоза в пълна кръв при 12-месечни мишки.

По-старите мишки GPR3 ​​KO са намалили общия разход на енергия

Непряката калориметрия разкрива забележимо и трайно намаляване на общия енергиен разход при по-стари мишки GPR3 ​​KO (TEE; фиг. 2А) без значителна промяна в дихателния им коефициент (RQ; фиг. 2В). Намаляването на TEE е свързано със съпътстващи спада на консумацията на кислород и производството на въглероден диоксид в групата GPR3 ​​KO (Фигура S1). Приемът на храна също е бил по-нисък при GPR3 ​​KO мишки, отколкото при техните WT поколения (фиг. 2C), докато, което е важно, амбулаторната активност остава сходна между генотиповете (фиг. 2D). Тези метаболитни разлики са сходни по време на светлата и тъмната фази (фиг. 2, десни панели) и са в хармония с фенотипа със затлъстяване.

Метаболитни профили на по-стари GPR3 ​​мишки, анализирани с помощта на индиректна калориметрия.

GPR3 KO мишките показват фенотип със затлъстяване със закъснение

За да изследваме временната динамика на фенотипа GPR3 ​​KO, проследихме телесното тегло на стандартни мишки, хранени с чау в продължение на до 18 месеца. Както е показано на Фиг. 3А, телесното тегло не се различава между WT и GPR3 ​​KO мишките през първите 5 месеца от живота, но GPR3 ​​KO мишките натрупват значително повече тегло след това. На възраст от 5 месеца и двете групи имат сходни стойности на TEE, RQ, прием на храна и амбулаторна активност (Фиг. 3B – E). Те също имат сходно съдържание на фекални триглицериди (Фигура S2), което предполага сравними способности за абсорбция на червата. С напредването на възрастта на животните мишките GPR3 ​​KO започнаха да наддават значително повече тегло. За да разберем по-добре защо GPR3 ​​KO мишките развиват затлъстяване по-късно в живота, проведохме допълнителни проучвания върху 5-месечни (възрастни) животни, тъй като това беше най-късният момент преди фенотипът на затлъстяването да стане очевиден.

Мишките GPR3 ​​KO показват фенотип със затлъстяване със късно начало с непроменен метаболитен профил до зряла възраст.

Възрастните мишки GPR3 ​​KO имат нарушено усвояване на глюкоза в iBAT

Първо направихме експерименти с хиперинсулинемична евгликемична скоба, за да изследваме тъканно специфични разлики в усвояването на глюкоза при 5-месечни мишки. На тази възраст животните с WT и GPR3 ​​KO все още имат сходни телесни тегла (съответно 31,55 ± 1,02 g и 31,06 ± 1,15 g; n = 6–7). Основни нива на глюкоза в кръвта преди фиксация (фиг. 4А), скорости на инфузия на глюкоза (GIR) и нива на глюкоза в кръвта по време на фиксиране (фиг. 4А – В), клирънс на глюкозата в цялото тяло (Rd; фиг. 4С) и инсулиново индуцирано потискане на производството на чернодробна глюкоза (hGP; Фиг. 4D) също са сходни при възрастни GPR3 ​​генотипове. И все пак, имаше някои видими разлики между WT и GPR3 ​​KO мишките в усвояването на глюкоза в отделни тъкани (Фиг. 4Е). Особено забележително е двукратното по-ниско поглъщане на глюкоза в iBAT на GPR3 ​​KO мишки в сравнение с техните WT аналози. За разлика от това, усвояването на глюкоза е значително по-високо в епидидималната мастна тъкан на мишките GPR3 ​​KO, докато остава сходно между групите в подкожната и периреналната мазнини, черния дроб и гастрокнемичния мускул и в хипоталамуса (фиг. 4Е).

Гликемичен контрол при възрастни GPR3 ​​мишки.

Молекулярните промени в iBAT на възрастни мишки GPR3 ​​KO предшестват намаляването на основната телесна температура на по-възрастните мишки

Не наблюдавахме съществени разлики в основната телесна температура през първите 5 месеца от живота, въпреки че телесната температура имаше тенденция да намалява по-бързо с времето при GPR3 ​​KO, отколкото при WT мишки. Когато животните достигнат 12-месечна възраст, телесната температура е била значително по-ниска при GPR3 ​​KO, отколкото при WT мишки и е останала по-ниска 6 месеца по-късно (Фиг. 5А). Това беше придружено от по-ниски нива на iBAT норепинефрин и по-ниски серумни тироксин (Т4), но не и концентрации на трийодтиронин (Т3) и тиреостимулиращ хормон (TSH) при 12-месечни мишки GPR3 ​​KO (Фигура S3). Понижаването на експресията на гена Gpr3 също се забелязва при 12-месечни WT мишки (фиг. 5В).

Термогенни характеристики на възрастни мишки GPR3.

На 5-месечна възраст мишките GPR3 ​​KO и WT са имали сравними нива на норепинефрин в тъканите и серумни концентрации на T3, T4 и TSH (Фигура S3). И все пак, въпреки нормалната телесна температура в покой, iBAT при възрастни GPR3 ​​KO мишки вече показва някои молекулярни промени, които са в хармония и предсказват загубата на термогенна функция в по-късна възраст. Мишки без GPR3 ​​са имали значително по-ниска базална експресия на несвързан протеин 1 (UCP1), активиран от пероксизома пролифератор рецептор-γ коактиватор 1 алфа (PGC1α) и тип 2 йодотиронин дейодиназа (Dio2), без промяна в гените, кодиращи адренергични рецептори, глюкозни транспортери, синтаза на мастни киселини или стеароил-КоА десатураза (фиг. 5С). Както се доказва от Western blot, iBAT на GPR3 ​​KO мишки също имаше значително намалено съдържание на UCP1 без разлика в нивото на протеин на субединица II на цитохром с оксидаза (MTCO2). Това наблюдение беше допълнително подкрепено от тяхната по-ниска интензивност на маркиране на флуоресценция на UCP1 на iBAT секции (Фиг. 5D).

За да проверим дали намаленият UCP1 протеин в iBAT има физиологично въздействие върху възрастни мишки GPR3 ​​KO, временно ги поставихме в студена среда (4 ˚C) и изследвахме способността да защитават основната им телесна температура след остро излагане на студ. Както е показано на фиг. 5Е, WT мишките са успели успешно да поддържат своята физиологична температура в студени камери по време на експеримента. За разлика от това, въпреки че имат нормална основна телесна температура при околна среда, сравними нива на iBAT норепинефрин и серумни маркери на функцията на щитовидната жлеза между групите по време на излагане на студ (Фигура S4), 5-месечните мишки GPR3 ​​KO показват нарушена толерантност към студ което се проявяваше с прогресивно намаляване на основните им телесни температури по време на студеното предизвикателство. В края на студената сесия телесната температура при мишките GPR3 ​​KO беше по-ниска със средно 0,9 ° C, отколкото при групата WT, докато телесната температура на възрастните мишки GPR3 ​​KO веднага се върна към нивата преди експозицията, след като животните бяха прехвърлени в техните домашни клетки при условия на околната среда (фиг. 5D).

Острото излагане на студ оказа силно влияние върху GPR3 експресия на иРНК в iBAT на WT мишки, която се е увеличила 17 пъти спрямо нивото в околните условия (фиг. 5Е). За разлика от тях, изразът на Gpr6 и Gpr12 остана непроменен (Фигура S5), докато промените в други гени, които представляват интерес по време на студеното предизвикателство, бяха доста скромни и следваха същия модел и в двете групи. Едно забележително изключение беше по-високото, евентуално компенсаторно увеличение на Dio2 генна експресия в GPR3 ​​KO спрямо тази при WT мишки (Фигура S6).

Горните резултати показват, че 5-месечните мишки GPR3 ​​KO, като същевременно поддържат нормални температури на сърцевината при околни условия, са компрометирани в способността си да защитават термичната хомеостаза по време на студеното предизвикателство.

Дискусия

Стареенето е неразривно свързано с метаболитни промени, които предразполагат човек към затлъстяване и свързани патологии. Въпреки припокриващите се сигнални пътища, факторите, които свързват стареенето със затлъстяването, остават до голяма степен неизвестни.

В настоящото проучване ние изследвахме ефектите от аблация на сираци GPR3 ​​върху енергийния метаболизъм при мишки. Този рецептор преди е бил замесен в преждевременно стареене на яйчниците 31,32,33 и невродегенеративни нарушения 34,35, като и двете са свързани с възрастта патологии. Тук за първи път съобщаваме, че мъжките мишки без GPR3 ​​показват затлъстяване със късно начало, когато се поддържат на редовна чау диета. Телесното тегло и метаболитните профили не се различават сред мъжките GPR3 ​​KO и WT групи през първите 5 месеца от живота, след което телесното тегло се увеличава систематично и по специфичен за генотипа начин, така че до 12-месечна възраст GPR3 ​​KO мишките са значително по-тежки от техните сънародници в WT, поради значително по-висок индекс на затлъстяване и свързани с нарушена термогенеза. Ефект на дозиране на гена е очевиден и при междинния фенотип на хетерозиготни животни. Женските мишки GPR3 ​​KO са наддали значително по-малко тегло от мъжете, което показва, че преждевременното стареене на яйчниците е малко вероятно да бъде отговорно за фенотипа със затлъстяване и ако изобщо може да ограничи експресията на този фенотип при женски мишки.

Въпреки наднорменото тегло, метаболитният профил на 12-месечни мишки GPR3 ​​KO не показва класически системни характеристики на метаболитния синдром. Аблацията на GPR3 ​​не причинява системна хипергликемия, хиперинсулинемия, дислипидемия, увреждане на черния дроб или промяна на основните метаболитни маркери при условия на гладуване. Както се отразява от тестовете GTT и ITT, 12-месечните мишки GPR3 ​​KO са непоносими към глюкоза, но остават чувствителни към инсулин, съвместими със състояние на по-ниско използване на енергия.

В заключение, както е обобщено на фиг. 6, настоящите открития установяват връзка между свързаните с възрастта промени в термогенезата и наддаването на тегло чрез рецептора сирак GPR3. Мишките, които нямат GPR3, показват закъснял фенотип със затлъстяване поради нарушена термогенна функция на iBAT. Следователно GPR3 ​​може да служи като нова фармакологична цел при разработването на подходяща терапевтична интервенция за лечение на затлъстяване при застаряващото население.

Обобщение на промените в фенотипа при мишки с дефицит на GPR3.