Редактирано от Сюзън Готсман, Национален здравен институт, Бетесда, MD, и одобрено на 20 август 2003 г. (получено за преглед на 16 юни 2003 г.)

лизин

Резюме

L гени за биосинтез на лизин. (А) Път на биосинтеза на лизин в B. subtilis. Гените, за които е установено, че съдържат лидери на L кутия във всеки организъм, са етикетирани (виж Таблица 2, която е публикувана като подкрепяща информация на уебсайта на PNAS, www.pnas.org), а съответният ензимен продукт е показан в скоби. В B. subtilis са идентифицирани три гена, кодиращи аспартокиназа; lysC кодира аспартокиназа II, реагиращата на лизин форма на ензима. Алтернативните роли на съединенията по този път са показани с пунктирани стрелки. (Б) Структури на лизин и сродни съединения.

В това проучване ние използваме филогенетични анализи на гени за биосинтез на лизин, за да разкрием сложен лидер РНК структурен масив, който се запазва в различни организми, включително членове на ниско G + C Грам-положителните бактерии и γ-протеобактериите. Тези РНК показват много сходен модел на вторични структурни характеристики, въпреки много малкото запазване на първичната последователност. В лизиновите гени от Грам-положителни организми бяха открити терминиращи транскрипции и конкуриращи се антитерминатори и беше доказано, че терминирането на гена на B. subtilis lysC се случва в директен отговор на лизин. За разлика от тях, гените от Грам-отрицателни организми изглежда са регулирани на нивото на иницииране на транслацията.

Материали и методи

Структурен модел на лидера на B. subtilis lysC. Номерирането е спрямо началната точка на транскрипцията (10). Helices 1–5 са обозначени с номера в кутия. Т, терминатор; AT, антитерминатор; AAT, анти-антитерминатор. Антитерминаторът се формира чрез сдвояване на остатъци от позиции 191–217 с остатъци от позиции 223–255. Червени остатъци се намират в 100% от последователностите, а сините остатъци се намират в> 80% от последователностите (Фиг. 5); зелените остатъци и пунктирани линии показват възможно третично взаимодействие между контурите на спиралите 2 и 3. Кухите малки букви показват мутации, показани преди това, за да предизвикат устойчивост на AEC и/или конститутивна експресия на lysC (референции 9 и 10 и H. Paulus, лична комуникация ). Мутациите, конструирани в това проучване (Xba-1, Xba-2, Xba-3), са обозначени с плътни малки букви. Промените в последователността на мутантите са: Xba-1, A31U/A32C/G33U/U35G; Xba-2, G108U/C110U/G111A/A112G; Xba-3, A198C/C200A/U201G/C202A. Putative S-turn и GA мотив елементи са етикетирани.

Анализи за транскрипция in vitro. Шаблони за in vitro транскрипция са генерирани чрез PCR, като се използват олигонуклеотидни праймери, които съдържат промоторния регион на B. subtilis glyQS (12) и се хибридизират в лидерния регион на гена lysC на B. subtilis. Полученият PCR продукт съдържа промотора на глиQS, слят към лидерната област на lysC, така че транскрипцията инициира 1 nt нагоре от С17 от lysC транскрипта (10). Това място е избрано, за да позволи иницииране с динуклеотид ApC и спиране в позиция G42 (фиг. 2) чрез иницииране в отсъствие на CTP. Промоторът-дисталният край на PCR фрагмента беше 95 bp надолу по веригата от мястото на терминация на лидерния регион, за да позволи разрешаване на прекратени и прочетени продукти (съответно 253 и 348 nt). PCR продуктите се пречистват с Qiagen PCR комплект за почистване (Qiagen, Chatsworth, CA). Шаблоните за мутанти на лидерски регион са генерирани чрез PCR с матрични ДНК, съдържащи подходящите алели. Описан е шаблонът ykrW (15).

Реакциите на транскрипция с един кръг бяха проведени, както е описано (12) с матрична ДНК (10 пМ) и His-маркирана РНК полимераза на B. subtilis (RNAP) (6 пМ), пречистена, както е описано от Qi и Hulett (25). Иницииращите реакции, съдържащи 1 × буфер за транскрипция (26), ApC (150 μM; Sigma), GTP (2.5 μM), ATP (2.5 μM), UTP (0.75 μM) и [α- 32 P] UTP (0.25 μM, 800 Ci/mmol; 1 Ci = 37 GBq), се инкубират при 37 ° С в продължение на 15 минути. Хепарин (20 μg/ml; Sigma) се добавя, за да блокира повторното иницииране и удължаването се предизвиква чрез добавяне на NTPs до 10 μM в присъствието на други реагенти, както е посочено. Реакциите на удължаване се инкубират при 37 ° С за допълнителни 15 минути и се прекратяват чрез екстракция с фенол. Продуктите за транскрипция бяха разделени чрез денатуриране на PAGE и визуализирани чрез анализ на PhosphorImager (Molecular Dynamics).

Резултати

Структурно подреждане на мотива L кутия. Моделът на L регион на L кутия се състои от пет винтови домена (спирали 1–5) нагоре от вътрешния терминатор на лидерната област (Фиг. 2); в гените от грам-отрицателни организми (всички от които са lysC), терминаторната спирала е заменена от спирална структура, която включва последователността на lysC Shine-Dalgarno, което предполага, че тя функционира, за да блокира достъпа на рибозомата до иРНК. Във всеки лидер може да се формира алтернативна структура, която сдвоява последователности от 3 'страна на спирала 1 с последователности от 5' страна на терминатора (или транслационна спирачна спирала), така че двете структури се взаимно изключват. Предлага се този алтернативен елемент да служи като антитерминатор (за гените от Грам-положителни организми) или като антирепресор на транслацията (за гените от Грам-отрицателни организми).

Петте винтови домена на L кутията излъчват от централно ядро ​​(фиг. 2). Областта на свързване между спирали 1 и 2 съдържа запазена AGG последователност, непосредствено съседна на спирала 1. Спирала 2 съдържа две последователно поставени вътрешни бримки. Примката, близка до централната сърцевина, съдържа запазени 5'-AGUA-3 'и 5'-GAAA-3' елементи от противоположните страни, разположение, съответстващо на структурния мотив на S-turn (или loop E) RNA, който придава обърнете се към гръбнака на спиралата (27). Дисталната вътрешна верига на спирала 2 е асиметрична, с противоположни GA остатъци; тази подредба съответства на GA мотива, намерен както в T box, така и в S box лидер РНК (28) и съответства на kink-turn мотива, който образува изкривяване в RNA скелета (29). GA мотивът отсъства в гените на кутията Staphylococcus L, докато мотивът S-turn е по-малко забележим при лидерите на грам-отрицателен произход; всички домейни на helix 2 обаче съдържат два вътрешни цикъла, поне един от които отговаря на модела на S-turn или GA мотив.

Helices 3 и 4 изглежда са прости елементи, които обикновено включват слаби двойки (G: U или U: G колебливи двойки, срязани G: A двойки или несъответствия). Цикълът на спирала 4 показва значително запазване на първичната последователност, а спиралите 3 и 4 са оградени от много силно запазени остатъци (фиг. 2). Helix 5 е сравнително кратък в гените с Грам-положителен произход и е удължен в гените на Грам-отрицателен произход; лидерът на Klebsiella pneumoniae lysC съдържа два допълнителни спирални елемента в спиралата 5. Съединението между спирали 5 и 1 съдържа запазени GAG остатъци, обикновено незабавно 3 ′ до спирала 5. Остатъци, образуващи базови двойки в областите на свързване на всяка спирала, също се запазват в първично ниво на последователност, което предполага, че структурната подредба в основната област е строго ограничена.

За да получим по-нататъшна представа за възможната третична структура на мотива на L кутията, изследвахме всички несдвоени региони за допълване. Примките на спиралите 2 и 3 показват допълнителни остатъци, обикновено с 5 nt, способни да се сдвояват; двете циклични последователности показват обширна ковариация. Вътрешните контури в спиралата 2 и слабите двойки в спиралата 3 могат да допринесат за способността на тези области на вериги да си взаимодействат. Запазените остатъци в зоната на сърцевината на кръстовището на спиралите 1–5 имат потенциал да образуват допълнителни сдвоявания, но много високата запазеност предотвратява потвърждаване чрез ковариация.

Ефект на мутациите на регионалния лидер на lysC. Във всяка водеща РНК спиралата на терминатора (или транслационния репресор) се предвижда (въз основа на дължината на спиралата и броя на двойките GC) да бъде по-малко стабилна от конкурентната спирала на антитерминатора (или антирепресора), която се формира чрез сдвояване на последователности на 5 ′ страна на терминатора с последователности от 3 'страна на спирала 1, често включваща последователности в областта между спирала 5 и спирала 1. Тази подредба предполага модел, в който спирала 1 служи като анти-антитерминатор, който предотвратява образуването на антитерминатор и следователно насърчава прекратяването, когато лизинът е в изобилие.

Лизинът насърчава прекратяването на транскрипцията по време на ин витро транскрипция от B. subtilis RNAP. ДНК шаблони, съдържащи промотора на B. subtilis glyQS, слети до позиция С17 на лидера на B. subtilis lysC, бяха създадени, за да позволят изследване на регулаторните свойства на лидерната последователност, независимо от промотора на lysC. Четенето на терминатора на лидерната област беше ефективно в отсъствие на лизин и терминирането беше стимулирано чрез добавяне на 1-лизин при 3 mM (Фиг. 3А, линии 1 и 2). Отговорът на лизин беше специфичен, тъй като DAP и SAM нямаха ефект (Фиг. 3А, линии 3 и 5); AEC проявява по-слаба терминационна активност (фиг. 3А, път 4) и се изисква 10-кратно увеличение на концентрацията на AEC, за да се даде отговор, сравним с този, наблюдаван при лизин (данните не са показани). Лизинът не е имал ефект върху прекратяването на ykrW S лидера на кутията (фиг. 3А, платно 7), който вместо това реагира на SAM (фиг. 3А, платно 8 и реф. 15). Тези резултати показват, че лизинът специфично насърчава прекратяването на лидера на lysC и обикновено не причинява прекратяване на транскрипцията от B. subtilis RNAP. Подобни резултати бяха получени и с E. coli RNAP (данните не са показани), което показва, че ефектът е независим от източника на RNAP.

In vitro транскрипция на B. subtilis lysC. Стрелките показват позициите на прочетените (RT) и прекратените (T) преписи. Процентното прекратяване (% T) е показано в долната част на всяка лента. ДНК шаблони (lysC или ykrW) се транскрибират с B. subtilis RNAP. (А) Прекратяване на транскрипция в зависимост от лизин. Прибавят се лизин (lys), DAP, AEC и SAM при 3 mM. (B) In vitro транскрипция на мутантни lysC шаблони. Прибавя се лизин при 3 mM (+). WT, WT lysC; Мутация на Xba-1, Xba-1; Мутация на Xba-2, Xba-2; Мутация на Xba-3, Xba-3; Xba-1/3, Xba-1 и Xba-3 двоен мутант. Мутациите са показани на фиг. 2.

Ефектът на лидерски мутации върху лизин-насочено прекратяване in vitro също беше тестван (Фиг. 3В). Мутациите Xba-1 и Xba-2 водят до загуба на терминация, в съответствие с резултатите in vivo. Мутацията Xba-3, която засяга остатъците от 3 'страна на спирала 1 (фиг. 2), води до увеличаване на терминацията, независимо от присъствието на лизин, което показва, че нарушаването на спирала 1 блокира отговора към лизин; неуспехът на тази мутация да осигури пълна загуба на отчитане е в съответствие с резултатите in vivo и може да бъде причинен от факта, че този алел не нарушава напълно антитерминаторния елемент. Предвижда се комбинация от алеи Xba-1 и Xba-3 да възстанови сдвояването в спирала 1, с повишаване на стабилността на спиралата. Двойният мутант показва повишен терминант спрямо мутанта Xba-3, в съответствие с прогнозата, че образуването на спирала 1 насърчава терминирането. Липсата на отговор на лизин може да бъде причинена от лизин-независима стабилизация на анти-антитерминатора и дестабилизация на антитерминатора и/или от ефекти на промените в последователността върху свързването на лизин. Като цяло тези резултати осигуряват подкрепа за модела и за хипотезата, че прочетеното е състоянието по подразбиране на системата.

Зависим от лизин структурен преход в lysC РНК. (А) Структурен модел на лидера на B. subtilis lysC в прочетените (-лизин) и терминационни (+ лизин) конформации. Показани са позиции на сдвояване на антисенс олигонуклеотиди а и b, позиции на мутации Xba-1 и Xba-2 (фиг. 2) и крайни точки на транскрипционни продукти. (B) Антисенс олигонуклеотид а-насочено RNase H разцепване на транскрипти, съдържащи lysC последователности от +17 до +228 (211-nt транскрипт, съдържащ 5 'страна на антитерминатора, но не и 3' страна). Транскрипцията беше в присъствието (+) или отсъствието (-) на лизин (3 тМ). Стрелките показват продуктите на разцепване на RNase H, които се наблюдават само при добавяне на олигонуклеотид. (C) Антисенс олигонуклеотид b-насочено RNase H разцепване на транскрипти, съдържащи lysC последователности от +17 до +253 (236-nt транскрипт, съдържащ целия антитерминатор, но липсващ 3 'страна на терминатора). Стрелките показват продуктите на разцепване на RNase H, които се наблюдават само при добавяне на олигонуклеотид.

Дискусия

За разлика от DAP, AEC не е нормален клетъчен компонент. AEC се различава от лизина чрез заместване на единичен въглерод със сяра (фиг. 1В). Устойчивостта на AEC при B. subtilis и Е. coli може да бъде резултат от дерепресия на експресията на lysC; идентифицирането на модела на L кутията дава обяснение за ефекта на предварително характеризираните AEC R мутации (справки 8-10 и H. Paulus, лична комуникация). Увеличението на активността на аспартокиназа II, наблюдавано при мутантите, очевидно е достатъчно за натрупване на по-високи лизинови пулове, които намаляват неправилното включване на AEC. Алтернативна възможност е AEC да действа като имитатор на лизин, потискайки експресията на гена на L кутия, така че резистентността да възникне чрез загуба на репресия от AEC. Изискването за 10-кратно по-високи концентрации на AEC от лизина за ефективно прекратяване на транскрипцията на lysC in vitro предполага, че AEC е малко вероятно да причини репресия на lysC in vivo.

Забележително е, че във всяка регулаторна система, която използва водещи РНК за директно наблюдение на ефекторна молекула, има много висока специфичност за сродния ефектор. Например, РНК-лидерите на T box селективно разпознават само сродните тРНК и допълнително различават между незаредена и заредена тРНК. РНК на S кутията реагират на SAM, но не и на S-аденозилхомоцистеин. РНК на L кутията са специфични за лизин, а не за DAP. Тази специфичност е присъщо изискване за биологичната функция на тези сензорни РНК при наблюдение на физиологичните сигнали в сложната среда на клетката. Ще бъде от голям интерес да се сравнят характеристиките на всяка група РНК, необходими за разпознаване на сродния ефектор и дискриминация на сродни молекули.

Благодарности

Благодарим на H. Paulus за предоставяне на непубликувани данни за AEC R мутации и експресия на lysC и F. M. Hulett за предоставяне на щама за производството на B. subtilis RNAP. Тази работа беше подкрепена от Националния здравен институт Grant GM63615.