Лаборатории за изследване на диабета на Гифорд и отдели на

Лаборатории за изследване на диабета на Гифорд и отдели на

Лаборатории за изследване на диабета на Гифорд и отдели на

Фармакология, Югозападен медицински център на Тексаския университет, Далас, Тексас 75235

Лаборатории за изследване на диабета на Гифорд и отдели на

Резюме

Към днешна дата проучванията за ефикасността на терапията с лептин при негенетични животински модели на затлъстяване и при затлъстяване при хора се концентрират върху многократна инжекционна терапия със смесени резултати. По този начин при животни с високо съдържание на мазнини (HF), широко използван модел на затлъстяване, интраперитонеалното доставяне на рекомбинантен лептин намалява приема на храна и наддаването на тегло (4, 8). Тези проучвания обаче не разглеждат способността на терапията с лептин да обърне метаболитните аномалии, свързани с храненето с високо съдържание на мазнини. Проучванията при хора съобщават за загуба на тегло в отговор на доставка на лептин чрез инжектиране (7), но загубите обикновено са незначителни в сравнение с теглото на тези индивиди преди започване на терапията с лептин. Инжекционната терапия с лептин може да се усложни от краткия полуживот на пептида в кръвообращението (16, 31). По този начин по-ефективната терапия може да изисква продължително, стабилно повишаване на нивата на лептин. В действителност, скорошно проучване демонстрира по-голямата ефективност на трайното повишаване на лептина в сравнение с интраперитонеалната доставка на лептин при намаляване на приема на храна и наддаване на тегло воб/об мишка (16).

По-рано демонстрирахме, че трайна, умерена хиперлептинемия може да бъде постигната при нормални плъхове чрез използване на система за доставяне на рекомбинантен аденовирусен ген (5, 19). В настоящото проучване ние използвахме тази система за индуциране на хиперлептинемия при HF плъх и тествахме ефектите от тази генно-терапевтична интервенция върху метаболитните аномалии, свързани със затлъстяването. Резултатите показват, че хипергликемията, хиперинсулинемията и инсулиновата резистентност на скелетните мускули се коригират чрез продължително, умерено повишаване на плазмения лептин. Обръщането на инсулиновата резистентност на скелетните мускули е силно свързано с намаляване на нивата на мускулните триглицериди.

Грижи и поддръжка на животни.

Мъжките плъхове Wistar са закупени от Charles River, с тегло 150–175 g. След пристигането плъховете бяха поставени в клетки поотделно със свободен достъп до вода и диета с високо съдържание на мазнини (HF диета, 45% от калориите от мазнини, Harlan Teklad, Madison WI., TD 96001) или стандартна диета с плъхове (SC диета, 11 % от калориите от мазнини, Harlan Teklad), с изключение на случаите, посочени по-долу, и приемът на храна и телесното тегло се записват ежедневно. Животните бяха държани на 12: 12-часов цикъл светлина-тъмнина.

Експериментален дизайн.

Тестове за перорален глюкозен толеранс и измерване на стимулираното от инсулин усвояване на глюкоза в скелетните мускули.

Триглицериди на скелетните мускули.

Мускулните триглицериди се определят, както е описано по-горе (28) с леки модификации. Накратко, замразените мускулни проби първо са прахообразни под течен азот. След това двадесет до петдесет милиграма замразена мускулна пудра се претеглят в 1 ml смес хлороформ-метанол (2: 1) и се инкубират в продължение на 1 h при стайна температура с периодично разклащане за извличане на липида. След добавяне на 200 μl H2O, завихряне и центрофугиране за 5 минути при 3000 ж, долната липидна фаза се събира и суши при стайна температура. Липидната пелета се разтваря повторно в 60 μl трет-бутанол и 40 μl смес от Triton X-114-метанол (2: 1) и триглицеридите се измерват с помощта на GPO-триглицериден комплект (Sigma, Сейнт Луис, МО) с линтрол липиди като стандарти (Sigma).

Измервания на плазмата.

Плазмените триглицериди и свободните мастни киселини са измерени с комплекти от Sigma и Boehringer Mannheim, съответно. Плазмената глюкоза се измерва с анализатор на глюкоза HemoCue (HemoCue AB). Плазменият лептин и инсулин са измерени с помощта на RIA комплекти, специфични за плъхове (Linco Research, St. Charles, MO).

Статистически методи.

Всички резултати са изразени като средства за 4–10 независими експеримента ± SE. Статистическата значимост се определя от несдвоена ученическа т-тест с помощта на статистическия модул на Microsoft Excel, версия 5.0 (Microsoft, Сиатъл, Вашингтон). Статистическата значимост беше приета при P

Таблица 1. Базални променливи при плъхове SC и HF

Плъховете Wistar са хранени с високо съдържание на мазнини (HF) или със стандартна чау (SC) диета за 6 седмици. Преди събиране на проби, животните са гладували в продължение на 18 часа. Резултатите са представени като средни стойности ± SE. FFA, свободни мастни киселини.

‡ Значителни разлики между HF и SC животни при P

хипергликемия

Фиг. 1.Мъжки плъхове Wistar са хранени с високо съдържание на мазнини (HF) или със стандартна чау (SC) диета за 6 седмици; н = 4 животни за всяко състояние. В края на периода всички животни са гладували цяла нощ (18 часа) и след това са получавали 2,0 g/kg глюкоза чрез сонда. Взети са проби от кръвта на опашната вена 0, 30, 60, 90 и 120 минути след сонда и са измерени нивата на кръвната глюкоза. *, ** Значителна разлика между HF и SC животни при P


Фиг. 2.Мъжките плъхове Wistar са хранени с HF или SC диета за 6 седмици. В края на периода всички животни са гладували цяла нощ (18 часа), мускулите на солеуса се изрязват и поглъщането на 2-деоксиглюкоза (2-DG) се измерва в отсъствие (базално) или наличие (+ инсулин) на инсулин. *** Значителна разлика между HF и SC групите (P

Лептиново действие при плъх с високо съдържание на мазнини.

След това определихме ефектите от продължително, умерено повишаване на лептина върху фенотипа със затлъстяване. Рекомбинантен аденовирус, съдържащ лептин cDNA, се прилага както на SC, така и на HF животни и се проследяват редица променливи на действието на лептин (Фиг. 3 и Таблица 2). Контролна HF група получи аденовирус, експресиращ β-галактозидаза, и приемът на храна впоследствие беше съпоставен с приема на храна при хиперлептинемични HF животни. Хиперлептинемията намалява приема на калории както при HF, така и при SC животни (Фиг. 3A), но намаляването е значително по-голямо при SC животни (Таблица 2). Кумулативната загуба на тегло, индуцирана от хиперлептинемия, е значителна при SC, но не и при HF животни (Таблица 2); обаче, когато се изрази като грамове, загубени на ден, HF плъховете са загубили значително тегло от ден 5 да се ден 6 на хиперлептинемия (фиг. 3Б.). Висцералната мастна маса беше значително намалена от хиперлептинемия при HF плъхове (Таблица 2) и загубата беше значително по-голяма в абсолютно изражение в сравнение с хиперлептинемична SC и калорично съвпадащи, третирани с AdCMV-βGal HF плъхове.

Фиг. 3.Мъжките плъхове Wistar са хранени с HF или SC диета за 6 седмици. В края на периода животните получават рекомбинантен аденовирус, кодиращ кДНК на лептин (HF-Lep,н = 9 и SC-Lep, н = 7). Прием на храна (A) и тегло (Б.) са били наблюдавани през следващите 6 дни. Контролната HF група получи рекомбинантен аденовирус, експресиращ β-галактозидаза и се поддържа на същия калориен прием като HF-Lep (HF-βGal-CM, н = 5). * Значителна разлика между HF-Lep и HF-βGal-CM (P

Таблица 2. Ефекти от 6-дневна хиперлептинемия или съвпадение на калориите върху теглото, приема на храна и висцералната мастна маса при HF и SC животни

HF-Lep, HF плъхове, прилагащи аденовирус, съдържащ лептин cDNA (AdCMV-лептин); SC-Lep, SC плъхове, прилагащи AdCMV-лептин; HF-βGal-CM, HF плъхове, прилагащи аденовирус, експресиращ β-галактозидаза (AdCMV-βGal) и калорично съвпадащи с HF-Lep. Всички резултати са изразени като средно ± SE.

‡ Значителни разлики между HF-Lep и SC-Lep при P F2-153 Значителна разлика между HF-Lep и HF-βGal-CM (P 1 В сравнение с масата на мазнините на високочестотни животни.

Ефекти на хиперлептинемията върху плазмените метаболитни променливи и чувствителността към инсулин на скелетните мускули.

Таблица 3. Ефекти от 6-дневна хиперлептинемия или съвпадение на калориите върху плазмените променливи при HF и SC плъхове

HF-Lep, HF плъхове, прилагащи AdCMV-лептин; SC-Lep, SC плъхове, прилагащи AdCMV-лептин; HF-βGal-CM, HF плъхове, прилагащи AdCMV-βGal и калорично съвпадащи с HF-Lep. Резултатите са представени като средни стойности ± SE.

F3-152 Значителна разлика от HF-βGal-CM (P

Фиг. 4.Мъжките плъхове Wistar са третирани, както е описано подробно в легендите на Фиг. 2 и 3. След бързо нощуване, измерването на 2-DG беше измерено в отсъствие (базално) или наличие (+ инсулин) на инсулин в мускулни препарати на солеус от SC (н = 9), HF (н = 9), SC-Lep (н = 5), хиперлептинемична СН (HF-Lep, н = 9) и HF-βGal-CM (н = 5). *** Значителна разлика между посочените и съответните HF групи (P


Фиг. 5.Мъжките плъхове Wistar са третирани, както е описано подробно в легендите на Фиг. 2 и 3. След бърза нощ, нивата на триглицеридите в скелетните мускули бяха измерени в SC (н = 9), HF (н = 9), SC-Lep (н = 5), HF-Lep (н = 9) и HF-βGal-CM (н = 5). *** Значителна разлика между посочената група и СН групата (P


Фиг. 6.Връзка между нивата на триглицеридите в скелетните мускули и стимулираното от инсулин поглъщане на 2-DG при СН, SC, хиперлептинемична СН (HF-Lep), хиперлептинемична SC (SC-Lep) и високочестотни плъхове, получили аденовирус, съдържащ β-галактозидаза cDNA (AdCMV-βGal) ) и впоследствие бяха калорично съчетани с HF-HL (HF-βGal-CM).

Способността на приложението на лептин да обърне метаболитните аномалии в об/об мишка (17, 21, 24) и подобряване на инсулиновото действие при нормални животни (1, 5, 26) доведе до предложението, че лептинът може да служи като ефективна терапия за затлъстяване при хора. Въпреки това редица въпроси остават без отговор в това отношение. Първо, не е ясно, че повишаването на плазмените нива на лептин ще бъде достатъчно за коригиране на метаболитните аномалии, свързани със затлъстяването, главно инсулинова резистентност и нарушен липиден и въглехидратен метаболизъм. Второ, лептиновата терапия, включваща многократни инжекции, има смесени резултати както при животински модели на затлъстяване, така и при опити при хора, и това предполага, че трябва да се обмислят алтернативни стратегии като продължително повишаване на плазмения лептин. Настоящото проучване разглежда тези въпроси при HF плъх, модел на затлъстяване, който показва метаболитен фенотип, подобен на този при човешкото затлъстяване.

Предишни проучвания в модела на HF със затлъстяване демонстрират, че приложението на лептин може да промени приема на храна и увеличаването на теглото (4, 8), но не е разгледало способността на лептина да коригира фенотипа на затлъстяването. Това е важен въпрос, тъй като корекция на метаболитните аномалии на затлъстяването с лептин е доказана само воб/об мишка, модел, в който липсва ендогенен лептин. По този начин настоящото проучване разширява предишните наблюдения на действието на лептин при затлъстяване, като демонстрира в негенетичен модел, че хипергликемията, хиперинсулинемията и инсулиновата резистентност на скелетните мускули се коригират чрез продължително, умерено повишаване на плазмения лептин, медиирано от приложението на рекомбинантен аденовирус. Важно е да не наблюдаваме подобна корекция на инсулиновото действие или плазмените променливи при HF животни, които са получили контролен аденовирус, експресиращ β-галактозидаза и са били калорично съчетани с HF хиперлептинемичните животни.

Тези проучвания са подкрепени от Национален здравен институт Grant P50H2598801 (на C. B. Newgard) и Novo Nordisk.

СТЪПКИ

Разходите за публикуване на тази статия бяха покрити отчасти чрез плащането на такси за страница. Следователно статията трябва да бъде маркирана с „реклама”В съответствие с 18 U.S.C. §1734 единствено за посочване на този факт.

ПРЕПРАТКИ

ЗАБЕЛЕЖКИ НА АВТОРА

Адрес за искания за препечатка и друга кореспонденция: R. M. O'Doherty, Univ. на Медицински център в Питсбърг, E1112 Biomedical Science Tower, Питсбърг, Пенсилвания 15261 (E-mail: [имейл защитен] dept-med. pitt. edu).