Доказано е, че късоверижните мастни киселини (SCFA), получени от ферментация на диетични фибри от чревната микробиота, подобряват чувствителността към гостоприемника към инсулина.
По-рано показахме, че допълването на диетата с инулин-пропионатен естер (IPE), предназначен да доставя SCFA пропионат в дебелото черво, подобрява глюкозната хомеостаза при хората, но основните механизми са неясни.
Значение на това проучване
Какви са новите открития?
Диетичните добавки с 20 g/ден IPE или високоферментиращият контролен инулин за влакна за 42 дни подобряват чувствителността към инсулин в сравнение с нискоферментиращата контролна целулоза при възрастни с наднормено тегло и затлъстяване. Няма разлики с IPE в сравнение с инулина.
Инсулинът на гладно след всеки период на добавяне е свързан с различни профили на плазмените метаболоми. Положителна връзка между плазмените N-ацетил гликопротеини и инсулина на гладно се наблюдава след добавяне на целулоза, което не е установено след добавяне на инулин или IPE. Тирозин (положително) и глицин (отрицателно) са свързани само с инсулин на гладно след добавяне на инулин.
Подобрението в метаболитното здраве с IPE по отношение на добавките на целулоза е придружено с намалени нива на възпалителния интерлевкин-8 (IL-8). Анализ in vitro установи, че мононуклеарните клетки от периферна кръв, изолирани от здрави хора, отделят по-малко IL-8 в среда, съдържаща натриев пропионат, в сравнение както с натриев ацетат, така и с натриев хлорид.
Добавката на IPE причинява промени в бактериалните популации на червата в сравнение с целулозата само на видово ниво. Добавките с инулин променят чревния бактериален състав както на ниво клас, така и на ниво по отношение на целулозата и насърчават бифидогенен ефект.
Как може да се отрази на клиничната практика в обозримо бъдеще?
Стратегии, които насърчават производството на пропионат на дебелото черво, могат да представляват по-целенасочен начин за подобряване на хомеостазата на глюкозата при отделни пациенти, в зависимост от основните механизми, допринасящи за метаболитното разстройство.
Въведение
Както в епидемиологичните проучвания, така и в рандомизираните контролирани проучвания, по-високият прием на диетични фибри е свързан с намален риск от диабет тип 2. Подобрението на метаболитните рискови фактори за здравето е най-голямо, когато приемът на диетични фибри надвишава 25 g/ден, 1 нивото на населението, средният прием е значително под това количество.2 Разбирането на механизмите, чрез които увеличеният прием на диетични фибри носи ползи за здравето, може да ни позволи да ги използваме за предотвратяване или лечение на метаболитни заболявания.
Приемът на диетични фибри модулира състава и активността на чревната микробиота.3 Подобряването на чувствителността на цялото тяло към инсулин след повишен прием на диетични фибри е свързано с повишеното производство на дебелото черво на ацетата, пропионата и бутирата на мастни киселини с къса верига (SCFA), основните крайни продукти от ферментацията на диетични фибри от чревните бактерии.4 5 Доказателствата при проучвания при хора показват, че увеличаването на приема на диетични фибри предпазва от наддаване на тегло6 7 и подобрява маркерите за инсулинова чувствителност.8-10 Тези положителни ефекти са наблюдавани при редица на хранителни добавки с фибри, включително пълнозърнести диети, 10 устойчиви нишестета9 и имулинови фруктани, 8 които произвеждат различни количества SCFAs в червата поради сложното взаимодействие между физикохимичните свойства на субстрата и чревната микробиота.
Резистентните към инсулин състояния, които се развиват с увеличаване на затлъстяването, са свързани с активирането на възпалителни реакции в различни места на органи, включително мастна тъкан, черен дроб и скелетни мускули, което увеличава секрецията и системните нива на възпалителни цитокини.21 Признато е, че повишените диетични фибри приемът и производството на SCFA имат силен ефект върху възпалителната и имунната функция на дебелото черво, до голяма степен чрез ефекти върху генерирането на регулаторни Т-клетки (Treg) 22 23 и мукозната секреция на IgA.24 Предишна работа подчертава, че SCFAs могат да повлияят и възпалителни и имунни отговори извън мястото на тяхното производство в периферните тъкани.24–26 Допълване на наивни Т-клетъчни култури с пропионат засилено развитие на Treg и намалено разширяване на възпалителните Th17 клетки.26 Подобренията в хомеостазата на глюкозата, които преди сме наблюдавали след дългосрочно доставяне на пропионат на дебелото черво да бъде обяснено отчасти с овлажняване на нискокачествения системен възпаление, придружаващо затлъстяването.
Въпреки че има все повече доказателства, че чревните бактерии играят роля в инсулиновата резистентност, механизмите не са напълно изяснени. Предишната ни работа изследва ефекта от увеличаването на производството на пропионат на дебелото черво върху бактериалния състав на червата, използвайки модели на ферментация на периодична култура in vitro и установява, че подобренията в метаболитното здраве на гостоприемника с добавки на IPE не се дължат на промени в изследваните популации на чревните бактерии., моделите на партидни култури нямат сложността на човешките черва; 16S рибозомна РНК (rRNA) генно секвениране на проби от изпражнения би позволило по-физиологично значимо и по-задълбочено изследване на въздействието на дългосрочното доставяне на пропионат на дебелото черво върху бактериалния състав на червата и свързването на тези промени с подобрения в метаболизма на гостоприемника.
Основната цел на настоящото проучване е да изясни основните механизми, които стоят зад подобренията в глюкозната хомеостаза след дългосрочно доставяне на пропионат в човешкото дебело черво. В предишните ни проучвания инулинът се използва като контрол, за да се отчетат промените в състава и метаболитната активност на чревната микробиота, които могат да произтичат от съдържанието на инулин в IPE.21 По-рано установихме, че 10 g/ден IPE подобрява холеостазата на глюкозата в сравнение с инулинов контрол, 16 18 обаче самият инулин се свързва с подобрения в метаболитните реакции в сравнение с неферментиращ или ниско ферментиращ контрол, особено когато се добавя във по-високи дози (> 15 g/ден) .8 27 Следователно, настоящото рандомизирано кръстосано проучване използва 20 g/ден IPE и инулин за изследване на общите механизми, лежащи в основата на подобренията в чувствителността към инсулин след диетични добавки с високо ферментиращи фибри и за разграничаването им от тези, задвижвани конкретно от селективната доставка на пропионат до човешкото дебело черво с IPE.
Методи
Всички участници са предоставили информирано писмено съгласие преди клиничното изпитване, което е одобрено от Лондонския комитет по етика на Brent (14/LO/0645). Изследването е проведено в съответствие с Декларацията от Хелзинки и е регистрирано в регистъра ISRCTN (ISRCTN71814178).
Допълнителен материал
В края на всеки 42-дневен период на добавки участниците присъстваха на Националния институт за здравни изследвания Имперски център за клинични изследвания, за да определят изходните мерки. Основният резултат е промяна в глюкозната хомеостаза. В деня преди проучвателните посещения участниците бяха помолени да се въздържат от интензивни упражнения и алкохол и да консумират стандартно вечерно хранене преди гладуване през нощта за> 10 часа.
Тест за смесено хранене
В антекубиталната вена се поставя канюла и се вземат две кръвни проби на гладно> на разстояние 5 минути. На 0 минути на участниците беше сервирано стандартно течно хранене (Ensure Plus, Abbott, UK: 660 kcal; 88,9 g въглехидрати, 21,6 g мазнини, 27,5 g протеин), което беше погълнато в рамките на 10 минути. Взети са постпрандиални кръвни проби на 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120 и 180 минути и са анализирани за глюкоза, инсулин, NEFA, активен глюкагон-подобен пептид 1 (GLP-1), общ пептид YY (PYY) и нива на SCFA. 1 H NMR спектроскопия беше извършена върху плазмени проби на гладно за анализ на метаболит. Подробно описание на събирането и анализа на кръвна проба е представено в онлайн допълнителния материал.
Имунно и възпалително фенотипизиране
IgA, IgG, IgM и С-реактивен протеин бяха измерени в проби от серум на гладно от Департамента по химическа патология, Национален здравен фонд на Imperial College Healthcare Trust. Интерлевкин (IL) -6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17A и фактор на туморна некроза алфа (TNF-α) се измерват в серум на гладно с помощта на цитометричен масив от зърна (BD Biosciences, UK), съгласно към протокола на производителя. Липополизахарид свързващият протеин (LBP) се измерва в серум на гладно чрез ELISA (Hycult Biotechnology, Холандия), съгласно протокола на производителя. Пълна кръв (30 ml) се събира в епруветки, покрити с хепарин, и се изолират мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC), като се използва Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, UK) и се криоконсервира в 10% диметилсулфоксид/фетален телешки серум. Подробно описание на PBMC анализа е представено в онлайн допълнителния материал.
Екстракция на ДНК на изпражненията и секвениране на 16S рРНК гени (метатаксономика)
Проба от изпражненията беше събрана от доброволци в последния ден от всеки период на добавяне. ДНК беше извлечена от всяка проба на изпражненията с помощта на PowerLyzer PowerSoil DNA Isolation Kit (Mo Bio, Carlsbad, CA, USA) следвайки инструкциите на производителя, с модификацията, че пробите бяха бити в продължение на 3 минути при скорост 8 в Bullet Blender Storm (Chembio, St Олбанс, Великобритания). Подробно описание на събирането на проби от изпражнения и метатаксономичния анализ е представено в онлайн допълнителния материал.
Изчисления и статистически анализ
Подробно описание на статистическия анализ е представено в допълнителните онлайн методи. Данните са представени като средни стойности ± SEM и p Вижте тази таблица:
- Преглед на линия
- Преглед на изскачащия прозорец
Характеристики на участниците в прожекцията
Концентрациите на SCFA в изпражненията не се различават след трите периода на добавяне (фигура 1А), но молният процент на пропионат е значително по-висок след добавяне на IPE в сравнение с целулозата (27,9 ± 2,6 срещу 21,0% ± 2,0%, p = 0,019; фигура 2В ). Няма разлики в общия или моларен процент на SCFA в кръв на гладно или след хранене между периодите на добавяне (фигура 1C, D; онлайн допълнителна таблица 2).
(A) Оценка на хомеостатичен модел 2-инсулинова резистентност (HOMA2-IR), (B) индекс на инсулинова чувствителност Matsuda (ISI), (C) инсулинова резистентност към мастната тъкан (AT-IR) и (D) инсулин на гладно след 42 дни целулоза, добавка на инулин и инулин-пропионатен естер (IPE). Всеки отделен символ представлява доброволец, а редовете представляват средна стойност ± SEM (n = 12). * P 1 H NMR спектроскопия е извършена върху плазмени проби на гладно и е моделиран наборът от изследвания на целулоза, инулин и IPE, където стойностите на инсулина на гладно са използвани като Y за изграждане на индивидуален модел за изпитване (таблица 2). Този анализ идентифицира често срещани метаболити, които са положително (валин и аргинин) и отрицателно (липопротеини с висока плътност и ненаситени липиди), свързани с инсулин на гладно след трите периода на добавяне. Глутаминът се свързва отрицателно с инсулин на гладно след добавяне на инулин и IPE, но не и целулоза, докато тирозинът (положително) и глицинът (отрицателно) се свързват само с инсулин на гладно след добавяне на инулин. N-ацетил гликопротеините са само положително свързани с инсулин на гладно след добавяне на целулоза.
Метаболити, наблюдавани в плазмата на гладно, които са били значително свързани с инсулин на гладно след 42 дни добавка на целулоза, инулин и инулин-пропионатен естер (IPE)
PBMCs, получени от участници след трите периода на добавяне, бяха оцветени с панел с имунно-фенотипиращи антитела (допълнителна онлайн таблица 6) за многопараметрична поточна цитометрия, за да се изследва потенциалната модулация на лимфоцитни подгрупи (фигура 3A-F). Средният дял на Treg сред CD4 + Т клетките в периферията се увеличава с добавки на инулин и IPE в сравнение с целулозата, въпреки че това не достига значимост (р = 0,104; фигура 3А). В допълнение, няма разлики в дела на периферните Th17 клетки (p = 0,179; фигура 3B), съотношението на Treg: Th17 клетки (p = 0,758; фигура 3C) или дела на CD19 + B клетки (фигура 3D, p = 0,920) между периодите на добавки. Като се има предвид интересът към потенциала на добавката на SCFA за модулиране на функцията на Т-клетките, ние също изследвахме отговорите на Т-клетъчния ефектор за извикване на антигени, използвайки вирусен пептиден басейн на цитомегаловирус/вирус Epstein-Barr/грип (CEF) и рекомбинантен антиген Pseudomonas, OprF Няма разлики в отговора на Т-клетките на CEF или OprF стимулация между периодите на добавяне (фигура 3E, F).
(A) Делът на CD4 + Treg и (B) Th17 клетки, (C) съотношението на Treg: Th17, (D) съотношението на CD19 + B клетки, (E) интерферон гама (IFNγ) Т клетъчна клетка, образуваща клетка отговор на пептидния пул на цитомегаловирус/Epstein-Barr вирус/грип (CMV/EBV/грип [CEF]) и (F) IFNγ T клетъчно петно, образуващо клетъчен отговор на антигена Pseudomonas aeruginosa, OprF, след 42 дни целулоза, инулин и добавка на инулин-пропионатен естер (IPE). Всеки отделен символ представлява доброволец, а редовете представляват средна стойност ± SEM (n = 12). (A) и (E) бяха анализирани чрез повтарящ се дисперсионен анализ (ANOVA). (B), (C), (D) и (F) бяха анализирани чрез тест на Friedman. sfc, клетка за образуване на петна.
Разликите в възпалителните и имунните маркери след трите периода на добавяне са представени в онлайн допълнителна таблица 7. IL-17 и TNF-α не са показани, тъй като само трима доброволци са имали откриваеми стойности за тези анализи. Добавките с IPE значително повишават нивата на IgG в сравнение с добавките с целулоза (10,29 ± 0,45 срещу 9,89 ± 0,38 g/L, p = 0,002; фигура 4А). В допълнение, добавката на IPE значително намалява нивата на IL-8 (фигура 4B) в сравнение с добавките на целулоза (5.86 ± 0.59 срещу 8.69 ± 1.74 pg/mL, p = 0.041), с тенденция, наблюдавана за разлика между стойностите на IPE и добавките на инулин ( 5,86 ± 0,59 срещу 8,05 ± 1,36 pg/ml; p = 0,050). Анализ in vitro (фигура 4С) установява, че здравите човешки PBMC, култивирани с натриев пропионат, секретират значително по-малко IL-8 в сравнение както с натриев хлорид (p = 0,021), така и с натриев ацетат (p = 0,040).
(A) IgG и (B) IL-8 в серум на гладно след 42 дни добавка на целулоза, инулин и инулин-пропионатен естер (IPE). Всеки отделен символ представлява доброволец, а редовете представляват средна стойност ± SEM (n = 12). (C) Освобождаване на IL-8 от мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC), изолирани от 12 здрави доброволци, култивирани за 48 г. с 4 тМ натриев хлорид, 4 тМ натриев ацетат и 4 тМ натриев пропионат. Концентрацията на IL-8, получена след култура само със среда, се изважда от третираните проби, за да се определи промяна в IL-8. Средно ± SEM (n = 12). * P 6 часа) с добавянето на ферментиращи субстрати към тестовото хранене може да е било необходимо, за да се наблюдават разликите в периферните циркулиращи нива на SCFA и техните потенциални ефекти върху чревното освобождаване на PYY и GLP-1. 48 Избрахме да не добавяме фибрите добавки към тестовото хранене, така че всеки наблюдаван ефект върху метаболизма след хранене да е независим от възможни остри промени в храносмилането и абсорбцията, причинени от физиохимичните свойства на всяка добавка от фибри.
В обобщение, в кохорта възрастни с наднормено тегло и затлъстяване добавките с инулин и IPE подобриха мерките за инсулинова резистентност спрямо целулозата, но няма значителна разлика между IPE и инулина. Въпреки това сравнимо подобрение с метаболитното здраве, добавката на IPE генерира различни ефекти върху бактериалните видове в червата и маркери за системно възпаление и имунна функция в сравнение с тези, наблюдавани при добавянето само на инулин. Взети заедно, настоящото проучване предполага, че манипулирането на профила на ферментация на дебелото черво на диетични фибри в полза на пропионат насърчава селективни ефекти върху механизмите, които допринасят за метаболитната дисрегулация. Би било интересно да се установят индивидуалните ефекти от доставянето на ацетат и бутират в дебелото черво, тъй като в бъдеще това би подпомогнало развитието на ферментируеми въглехидрати, които осигуряват специфичен SCFA профил за подобряване на метаболитното здраве и хомеостазата на глюкозата.