Роли Формален анализ, разследване, методология, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

експерименталната

Партньорски отдел по паразитология, Медицински център на Университета в Лайден, Лайден, Холандия

Роли Формален анализ, методология, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Присъединителен център за протеомика и метаболомика, Медицински център на университета в Лайден, Лайден, Холандия

Роли Формален анализ, визуализация

Афилиационен център за протеомика и метаболомика, Медицински център на университета в Лайден, Лайден, Холандия, Транслационна фармакология, Център за изследване на хронични заболявания, Медицинско училище NOVA, Лисабон, Португалия

Разследване на ролите, методология

Отделение по химия на Томския държавен университет, Томск, Руска федерация

Разследване на ролите, методология, ресурси

Свързаност Централна изследователска лаборатория Сибирски държавен медицински университет, Томск, Томск, Руска федерация

Разследване на ролите, методология, ресурси

Свързаност Централна изследователска лаборатория Сибирски държавен медицински университет, Томск, Томск, Руска федерация

Роли Концептуализация, придобиване на финансиране, надзор

Отделение за принадлежност към факултетска педиатрия, Сибирски държавен медицински университет, Томск, Томск, Руска федерация

Роли Администрация на проекта

Отделение по химия на Томския държавен университет, Томск, Руска федерация

Разследване на роли, администриране на проекти, ресурси, писане - оригинален проект

Присъединителна транслационна фармакология, Изследователски център за хронични заболявания, Медицинско училище NOVA, Лисабон, Португалия

Роли Концептуализация, формален анализ, методология, надзор, визуализация, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Присъединителен център за протеомика и метаболомика, Медицински център на университета в Лайден, Лайден, Холандия, Химически департамент, Томски държавен университет, Томск, Руска федерация

  • Дария А. Кокова,
  • Сарантос Костидис,
  • Джудит Морело,
  • Натали Дементева,
  • Екатерина А. Перина,
  • Владимир В. Иванов,
  • Людмила М. Огородова,
  • Алексей Е. Сазонов,
  • Ирина В. Салтикова,
  • Олег А. Майборода

Фигури

Резюме

Заден план

Описторхозата е паразитна инфекция, причинена от чернодробните метили от семейство Описторхии. Както експерименталните, така и епидемиологичните данни силно подкрепят ролята на тези паразити в етиологията на хепатобилиарните патологии и повишен риск от интрахепатален холангиокарцином. Разбирането на функционалната връзка между инфекцията и хепатобилиарните патологии изисква подробно описание взаимодействие гостоприемник-паразит на различни нива на биологична регулация, включително метаболитния отговор на инфекцията. Последният обаче остава практически без документи. Тук описваме отговора на гостоприемника на инфекция Opisthorchiidae с помощта на метаболомичен подход и представяме първото изследователско метаболомично проучване на експериментален модел на инфекция с O. felineus.

Методология и основни констатации

Проведохме надлъжно метаболомично изследване, базирано на ядрено-магнитен резонанс (ЯМР), включващо кохорта от 30 животни с две степени на инфекция и контролна група. Изследователски анализ показва, че най-забележимата тенденция (30% от общата дисперсия) в данните е свързана с различията между половете. Следователно беше направен допълнителен анализ на всяка полова група поотделно, като се прилага многовариантно разширение на ANOVA — ASCA (ANOVA едновременен компонент анализ). Ние показваме, че при мъжете специфичните времеви тенденции присъстват в основния компонент (43,5% отклонение), докато при жените той е представен само във втория компонент и обхваща 24% от отклонението. Избрахме и коментирахме 24 метаболита, свързани с наблюдаваните ефекти, и предоставихме физиологична интерпретация на находките.

Заключения

Представено е първото изследователско метаболомично изследване на експериментален модел на инфекция с O. felineus. Нашите данни показват, че в ранния стадий на инфекцията реакцията на организма се разгръща по специфичен за пола начин. Също така основните засегнати физиологични механизми изглеждат доста неспецифични (състояние на метаболитния стрес) данните предоставят набор от хипотези за търсене на по-специфичните метаболитни маркери на инфекцията Opisthorchiidae.

Резюме на автора

Описторхозата е паразитна инфекция, причинена от чернодробните метили от семейство Описторхии (Trematoda; Platyhelminthes). Инфекциите с чернодробна метила предизвикват развитие на хепатобилиарни патологии като хронични форми на холецистит, холангит, панкреатит и холелитиаза. Въпреки това, най-застрашаващият ефект от инфекцията на Opisthorchiidae е повишен риск от интрахепатален холангиокарцином. С тази работа ние получаваме представа за отговора на домакина на инфекция Opisthorchiidae, използвайки метаболомичен подход. Метаболомиката е постгеномна дисциплина, изучаваща метаболома. Динамичният характер на метаболома, способността му да се променя в отговор на външните дразнители го прави оптимално „отчитане“ за изследователски проучвания, целящи описанието на системните реакции на организма. Използвайки този подход, ние демонстрираме, че ранният отговор на инфекцията с O. felineus се развива по полово зависим начин. Освен това, с този първи изследователски анализ на метаболитния отговор на инфекция с O. felineus в животински модел, ние представяме подмножество от метаболитите, променящи се в ранната фаза на инфекцията, и предлагаме възможна физиологична интерпретация.

Цитат: Kokova DA, Kostidis S, Morello J, Dementeva N, Perina EA, Ivanov Ivanov, et al. (2017) Проучвателно метаболомично изследване на експерименталната описторхоза в лабораторен животински модел (златен хамстер, Mesocricetus auratus). PLoS Negl Trop Dis 11 (10): e0006044. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006044

Редактор: Джон Пий Далтън, Университет на кралица Белфаст, ОБЕДИНЕНОТО КРАЛСТВО

Получено: 12 юни 2017 г .; Прието: 17 октомври 2017 г .; Публикувано: 31 октомври 2017 г.

Наличност на данни: Минимален набор от данни (данните вече са обработени с помощта на спектрално свързване) се предоставя като поддържаща информация (информация за поддръжка 4) в съответствие с политиката за данни на PLOS. За пълните сурови данни, моля, свържете се с LUMC Център за протеомика и метаболомика на следния адрес: Rob Marissen [email protected].

Финансиране: Работата, подкрепена от Руската научна фондация (http://www.rscf.ru/en) [грант номер 14-15-00247]. Освен това J.M. беше подкрепен от Фондация за наука и технологии на Португалия (грант № SFRH/BSAB/114291/2016). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Описторхозата е паразитна инфекция, причинена от чернодробните метили от семейство Описторхии (Trematoda; Platyhelminthes). Семейството включва трите най-важни вида за човешкото здраве: C. sinensis, O. viverrini, O. felineus; те заедно са отговорни за над 45 милиона инфекции по целия свят; Понастоящем 600–750 милиона души са изложени на риск [1, 2]. O. viverrini и C. sinensis са ендемични за регионите на Далечния изток и Югоизточна Азия, оставайки важен проблем за общественото здраве [3]. Инфекцията с O. felineus е силно разпространена в Източна Европа (Украйна и европейската част на Русия), Централна Азия (Северен Казахстан) и Северна Азия (Сибир) [2]. Както експерименталните, така и епидемиологичните данни силно подкрепят ролята на инфекциите на чернодробния метил в етиологията на хепатобилиарните патологии като хронични форми на холецистит, холангит, панкреатит и холелитиаза [2–5]. Най-застрашаващият ефект от инфекцията на Opisthorchiidae обаче е повишен риск от интрахепатален холангиокарцином [6].

Тук представяме първото изследователско метаболомично проучване на експериментален модел на инфекция с O. felineus. Използвайки установен модел на хамстерска инфекция, ние проведохме метаболомично проучване, основано на ядрено-магнитен резонанс (ЯМР), включващо кохорта от 30 животни с две степени на инфекция (тежка и лека) и контролна група. Проби от урина се събират на всеки две седмици за период от няколко месеца. Използвайки комбинация от неконтролиран и контролиран многовариатен статистически анализ, успяхме да разграничим разрешените във времето уринарни метаболитни модели на инфекцията.

материали и методи

Декларация за етика

Всички хамстери, използвани в проучването, са обработвани в съответствие с препоръките на националните насоки за грижа за животните: 12.08.1977 г. N 755 "За мерки за по-нататъшно подобряване на организационните форми на работа с използване на опитни животни". Изследването е одобрено от местния етичен комитет на Сибирския държавен медицински университет с лиценз номер 3296, издаден на 29.04.2013.

Експериментален модел на описторхиаза

Броят на яйцата

Средният брой яйца на грам изпражнения се изчислява по модифицирания метод на Kato (Katz et al. 1972). Фекалната проба от всяко животно в изследваната точка от времето се смесва с Mini-Beadbeater-16 (Bio-Spec) в продължение на 5 минути. Проба от 25 mg от изпражненията се претегля с електронна везна (тип Sartorius 1702, чувствителност 0,1 mg) веднага след хомогенизиране. За всеки 25 mg изпражнения бяха приготвени две предметни стъкла. Екстраполацията на броя на яйцата на проба от 25 mg към стойностите на яйцата на грам се извършва чрез просто умножение (x 40).

Приготвяне на проба от урина

Всички химикали, използвани за буферния разтвор, са закупени от Sigma-Aldrich, с изключение на 2 H2O, която е закупена от Cortecnet и 3- (триметилсилил) пропионова-2,2,3,3-d4 киселина натриева сол (TSP) от Cambridge Isotope Laboratories Inc. 96-ямкови плаки и NMR епруветки са закупени от Bruker Biospin Ltd. (Германия).

Аликвотни части от 0,5 ml урина на проба се размразяват за една нощ при 4 ° С. След това клетъчните компоненти и други неразтворими материали се центрофугират в продължение на 10 минути при 3184 g и 4 ° С и супернатантите се прехвърлят в 96-ямкови плаки. 270 μL урина от всяка проба се смесват с 30 μL буферен разтвор в 2 H2O (pH = 7,4), съдържащ 1,5 M K2HPO4, 2 mM NaN3 и 4 mM TSP-2,2,3,3-d4 като вътрешен стандарт и референтна стойност на химичното изместване (0,4 mM крайна концентрация във всяка проба). И накрая, 165 μL от всяка урина-буферна смес бяха прехвърлени в 3 mm SampleJet NMR епруветки и поставени в хладилни стелажи (6 ° C) на система SampleJet до измерванията на NMR. Смесването на урината с буфер и прехвърлянето на сместа в ЯМР епруветки се извършват от два робота с манипулатор на течност 215 Gilson и се контролират от софтуера SampleTrack (Bruker Biospin Ltd.).

Прибиране на NMR данни

Двуизмерни J-разделителни спектри (2D Jres) също бяха събрани за всяка проба, използвайки същата схема за потискане на водата, както е описана по-горе по време на забавяне на релаксация от 2 s. Спектралната ширина беше зададена на 16,66 ppm (12288 Hz) за директния размер и 78 Hz за индиректния и бяха получени 2 сканирания за 40 стъпки. FID се обработват автоматично с преобразуване на Фурие и спектрите се отнасят към TSP сигнала при 0.0 ppm при F2 измерение и при 0.0 Hz при F1 измерение.

За целите на възлагането бяха получени и 2D ЯМР спектри, за да се направи проба, като се смесят всички проби от урина. Наборът от 2D експерименти включва 1 H-1 H корелационна спектроскопия (COZY), 1 H-1 H обща корелационна спектроскопия (TOCSY), 1 H-13 C хетероядрена единична квантова корелация (HSQC) и 1 H-13 C хетероядрена множествена връзка корелационна спектроскопия (HMBC), използвайки стандартните параметри, внедрени в библиотеката Topspin 3.0 (Bruker Biospin Ltd.).

Спектрална обработка на данни и анализ на данните

Предварителната обработка на NMR данни (файл S2), за да бъдат подходящи за статистически анализ, беше извършена с вътрешни процедури, написани в Matlab 2014a (The Mathworks, Inc., САЩ) и Python 2.7 (Python Software Foundation, www.python.org). Всички 1D NMR 1H спектри бяха преоценени за неправилни изходни линии и коригирани с помощта на полиномно напасване на степен 5. Спектралната област от 0,5 до 9,5 ppm беше смесена с помощта на вътрешен алгоритъм за адаптивно интелигентно свързване [18]. Първоначалната ширина на контейнера беше зададена на 0,02 ppm и крайните променливи размери на контейнерите бяха изчислени въз основа на пиковите ръбове в спектрите, като се използва критерий за най-ниско стандартно отклонение. Спектралната област, включваща остатъчната вода и пиковете на уреята (δ 4,5–6,2 ppm), беше изключена от данните.

Окончателните данни се състоят от 392 контейнера с променлив размер × 490 наблюдения (проби), които са нормализирани чрез метода за нормализиране на вероятностните коефициенти (PQN) [19], за да се коригират разликите в разреждането от пробата към пробата. И накрая, нормализираните данни бяха мащабирани до единична дисперсия за статистическия анализ.

Анализът на данните беше извършен с R статистическа среда ((http://www.r-project.org/, R версии 3.3.2). За изследователски анализ бяха използвани пакети „Rcpm“, „pcaMethods“ и „caret“. ASCA моделирането беше извършено с помощта на пакета „lmdme“ [20]. Визуализациите бяха направени с помощта на пакетите „ggplot2“, „cowplot“ и „gridExtra“.

Идентифициране на метаболитите

Идентифицирането на метаболитите беше извършено чрез изтощително търсене на общите 1D и 2D Jres данни, като се използват патентованите бази данни Bbiorefcode (Bruker Biospin Ltd.) и ChenomX NMR suite 8.1 (Chenonx Inc.). Идентификаторите на анотираните резонанси бяха допълнително проверени чрез събраните 2D NMR данни.

Резултати

Брой възрастни червеи и яйца

Дизайнът на изследването включва 30 животни, разделени в три групи: контролна незаразена група и двете експериментални групи, заразени с петнадесет и петдесет метацеркарии. Фигура 1. Всяка експериментална група се състои от равен брой мъжки и женски животни. Наборът от данни, описан в настоящия ръкопис, включва пробите от изходното ниво до тридесет и две седмици, събрани на всеки две седмици. Медианата на броя на червеите при възрастни в края на проучването е съответно 35 за тежка и 6 за група с лека интензивност на инфекцията (р-стойност = 0,003) (S1A Фиг.). Яйца от O. felineus са открити във всички фекални проби, започвайки от 4 седмици след инфекцията. S1B Фигура показва времевия ход на производството на яйца през целия период на експеримента. Той показва последователно нарастване на производството на яйца и за двете експериментални групи за период от 4 до 10 седмици. Ние разглеждаме промените в производството на яйца, свързани с различния стадий на инфекцията, а именно остър (до 10 седмици) и хроничен (от 10 седмици нататък). От 12-та до 30-та седмица на експеримента отделянето на яйцеклетки е стабилно и групата с висока инфекция има постоянно по-висок добив на яйца. Резултатът е значително по-висок през седмиците 12 (p-стойност = 0,002), 14 (p-стойност = 0,004), 16 (p-стойност = 0,030), 20 (p-стойност = 0,001), 26 (p-стойност = 0,001) и 28 (р-стойност = 0,009).

Изследователски анализ на метаболитните профили в урината

Анализ на специфичните за пола метаболитни промени в острата фаза на инфекцията

Данните, показани на фиг. 2, показват ясно, че директният анализ на зависимите от инфекцията промени ще бъде възпрепятстван от влиянието на половата и времева тенденция. По този начин, за да намалим сложността на анализа, решихме да се концентрираме върху периода от 0 до 10 седмици от експеримента: времева рамка, когато производството на яйца непрекъснато се увеличава (S1B Фиг.). Анализът беше извършен поотделно върху мъжките и женските подгрупи. Фигура 3 показва моделите PCA, изградени върху данните от седмица 0 до седмица 10 от експеримента. „Моделът от мъжки пол“ (Фигура 3А, 3В и 3С) изисква четири компонента, за да обясни 50% от дисперсията, а 42% от първите две. Изграждането на модела на данните, включващо само жени (Фигура 3D, 3E и 3F), изисква 6 компонента, за да обяснят 50% от дисперсията, а първите две обясняват 34%. И двата модела изглеждат доста сходни, но при прилагането на геометричния анализ на траекторията [21] (фиг. 3C и 3F) могат да бъдат разкрити някои основни разлики. Геометричните времеви траектории за заразените животни (групи E1 и E2) са ясно изразени в мъжкия модел (Фигура 3C). В същото време в женската подгрупа (Фиг. 3F) само траектория за силно заразени животни (E1) има отчетлива форма, траекторията за по-ниската инфекциозна група изглежда толкова случайна, колкото контролната.

Геометрични времеви траектории: C – мъже, F — жени.

Моделиране на ANOVA едновременен компонент (ASCA)

Дискусия

Тенденция, свързана с пола, обяснява приблизително 30% от дисперсията в данните; следователно беше направен допълнителен анализ на всяка подгрупа поотделно. Както неконтролираното многовариантно моделиране, така и анализът, базиран на ASCA, показват, че свързаният с времето отговор на инфекцията се развива по различен начин при мъжете и жените. Освен това, Фигура 4, която предоставя общ преглед на основните модели, свързани с взаимодействието време-инфекция, ясно показва, че при мъжкия модел отчетливата тенденция е налице в първия основен компонент, обхващащ двойно по-голяма дисперсия от женския модел, където е подобна тенденция видимо само във втория компонент. Естествено, дискусия за биологичното значение на наблюдаваните ефекти е възможна само ако знаем идентичността на метаболитите, влияещи върху моделите. Подгрупа от най-влиятелните единици е представена в таблица 1. Като цяло тя се появява като повече или по-малко стандартен набор от метаболити, които редовно се отчитат в NMR-базирани метаболомични проучвания на урината. Той също така има силно припокриване с метаболитите, съобщени в публикациите за шистосомоза, споменати по-горе.

Подкрепяща информация

S1 Фиг. Преглед на интензивността на инфекцията.

А. Брой червеи в края на експеримента; Б. Динамика във времето на производството на яйца.