H.Z. и пр.н.е. допринесе еднакво за това проучване.

гестационен

Резюме

Гестационният захарен диабет (GDM) е свързан с повишен риск от метаболитни нарушения при потомството в по-късна възраст. Въпреки че нарастващите данни сочат, че терапията за GDM може да подобри здравето на новороденото, дали терапията предоставя дългосрочни метаболитни ползи на потомството в по-късния им живот на възрастни, не е известно. Тук, използвайки миши модел на диабет през втората половина на бременността, за да имитира човешки GDM, откриваме, че ефективната инсулинова терапия за GDM предоставя значителна защита срещу непоносимост към глюкоза и затлъстяване при потомството, хранено с нормална чау-диета. Въпреки това, терапията не успява да защити потомството, когато е предизвикана с диета с високо съдържание на мазнини, особено за мъжкото потомство. Профилиране на ДНК метилиране на ДНК на панкреатични островчета от мъжки потомци идентифицира хиперметилирани области в няколко гена, които регулират секрецията на инсулин, включително Abcc8, Cav1.2 и Cav2.3, които кодират KATP или Ca 2+ канали, които са свързани с намалена генна експресия и нарушена секреция на инсулин. Това откритие предполага метилиран медииран епигенетичен механизъм за GDM-индуцирана междупоколенческа непоносимост към глюкоза. Той подчертава, че дори ефективната инсулинова терапия за GDM е недостатъчна, за да защити пълноценно потомството от индуцирани от диетата метаболитни нарушения.

Въведение

Гестационният захарен диабет (GDM), определен като непоносимост към глюкоза, диагностицирана за първи път по време на бременност, засяга до 15% от бременностите в света (1). GDM се свързва с неблагоприятни последици не само по време на развитието на плода, като мъртво раждане, висцеромегалия и макрозомия, но и по-късно в живота (2,3). Натрупващите се данни показват, че GDM, независимо от затлъстяването на майката и генетичния произход, предразполага потомството към метаболитни нарушения в по-късен живот, като затлъстяване, нарушен глюкозен толеранс и диабет (4–6). Надлъжните проучвания на потомство с GDM показват, че нивото на глюкозата при майките е силен предиктор за променен метаболизъм на въглехидратите по време на детството, който може да бъде удължен до зряла възраст.

Терапевтичното управление на GDM е от решаващо значение за минимизиране на тези усложнения. Гликемичният контрол е крайъгълният камък на управлението на GDM (9). Рандомизираните проучвания потвърдиха, че терапията за GDM носи незабавни ползи, като намаляване на перинаталните усложнения и разпространението на макрозомия (10,11). Все пак дали терапията за GDM предоставя дългосрочни метаболитни ползи на потомството все още не е ясно (12,13). Важното е, че подходящият период на проследяване на потомството за оценка на ефектите от GDM терапията все още е спорен. Потомците, включени в повечето последващи проучвания, са били преди пубертета (на възраст 5–10 години), но дългосрочният ефект на GDM върху метаболитните нарушения на потомството или неговото намаляване чрез терапия може да не е очевиден до юношеството или зрялата възраст (12,14).

Освен това сексът с потомство също има дълбок ефект. Сексуалният диморфизъм в отговор на обида вътреутробно се проявява с неравномерна податливост на заболяването: въпреки че и двата пола могат да бъдат засегнати, единият е по-податлив (15). Съществуват метаболитни разлики между мъжките и женските плодове (15) и различната чувствителност към майчината хипергликемия може да доведе до специфични за пола рискове от заболяване по-късно в живота (6,16). Данните от епидемиологичните проучвания показват, че ефектът от терапията за GDM също се различава с феталния пол в кърмаческа и детска възраст (11,16). Следователно феталният секс може да повлияе на ефекта, който терапията за GDM има върху здравето на потомството в дългосрочен план. Освен това социалните и екологичните фактори също могат да объркат резултатите от последващите действия. По този начин дали терапията за GDM е модифицируем рисков фактор за метаболитни нарушения на потомството остава неизвестно.

В механично отношение епигенетичните модификации, като метилиране на ДНК, модификация на хистон и некодиращи РНК, осигуряват правдоподобна връзка между експозицията на околната среда в началото на развитието и податливостта към болести по-късно в живота (17). ДНК метилирането, най-изследваната епигенетична модификация, може да промени състоянието на генната експресия и да се наследи митотично в соматични клетки (17,18), което осигурява потенциален механизъм, чрез който въздействието на околната среда върху епигенома може да има дългосрочни ефекти върху генната експресия . Резултатите от проучвания върху животни и хора потвърждават, че вътрематочната хипергликемия може да доведе до променени модели на метилиране на ДНК на плода и последващи промени в риска от развитие на заболяване (6,19). В епидемиологични и експериментални проучвания гликемичният контрол подобрява GDM неонаталните резултати. Въпреки това, нито едно проучване не е изследвало дали тези положителни ефекти са били придружени от благоприятно възстановяване на ДНК метилирането (20), което може да е критично важно за податливостта към болести по-късно в живота. По този начин възможността феталното метаболитно програмиране при GDM да има дългосрочен ефект върху здравето, което от своя страна може да бъде модифицирано от терапия за GDM, остава отворена под въпрос.

Тъй като изключването на объркващите фактори и анализирането на основните механизми при хората е трудно, ние установихме миши модел на диабет през втората половина на бременността, за да имитира човешки GDM с висока честота през третия триместър на бременността (21). Ние лекувахме хипергликемия на майката с инсулин и оценявахме функцията на β-клетъчните острови на панкреаса при потомството. Обсъдихме също така дали факторите на начина на живот в зряла възраст, като диета с високо съдържание на мазнини (HFD), могат да увеличат риска от развитие на метаболитни нарушения при потомството. И накрая, извършихме последователност на метилиране на ДНК в целия геном в потомство на панкреатични островчета и оценихме промените на кандидат-гените, които могат да допринесат за метаболитните фенотипи при потомството.

Изследователски дизайн и методи

Грижа за животните

Комитетът по грижа и употреба на животните от университета в Джъдзян одобри всички протоколи за животни. Всички експерименти бяха проведени с мишки на Institute of Cancer Research (ICR) (22), които бяха закупени от Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. (Shanghai, China). Девствените ICR жени (на възраст 6-8 седмици; тегло 26-28 g) са били чифтосвани с нормални ICR мъже. Бременността е датирана от наличието на вагинална запушалка (ден 0,5). Бременните жени бяха разпределени на случаен принцип за контролни (Ctrl), GDM или GDM + инсулинова терапия (INS) групи. На 6-ия ден и 12-ия ден от бременността язовирите с GDM и INS са гладували 8 часа и са получили инжекция със стрептозотоцин (STZ) (100 mg/kg ip) (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури) (23,24) (Фиг. . 1А). Контролните бременни мишки получават еднакъв обем цитратен буфер. Нивото на глюкоза в кръвта се измерва през опашната вена 48–72 часа след втората STZ инжекция, а диабетът се определя като ниво на глюкоза в кръвта между 14 и 19 mmol/L (6).

Експериментален дизайн, криви на растеж на потомството и глюкозен толеранс. О: Експериментален дизайн. B: Ниво на глюкоза в кръвта на майката по време на бременност (n = 6 мишки на група). C: Криви на постнатален растеж за мъжко потомство (nCtrl-F1_NCD = 8, nINS-F1_NCD = 10, nGDM-F1_NCD = 10, nCtrl-F1_HFD = 8, nINS-F1_HFD = 8, nGDM-F1_HFD = 10). AUC, площ под кривата; а.у. произволни единици. D: Криви на постнатален растеж за потомството на жените (nCtrl-F1_NCD = 7, nINS-F1_NCD = 7, nGDM-F1_NCD = 8, nCtrl-F1_HFD = 6, nINS-F1_HFD = 9, nGDM-F1_HFD = 7). E: Тест за толерантност към глюкоза и AUC на 20-седмично мъжко поколение F1 (nCtrl-F1_NCD = 6, nINS-F1_NCD = 7, nGDM-F1_NCD = 7, nCtrl-F1_HFD = 6, nINS-F1_HFD = 7, nGDM-F1_HFD-F1_HFD = 6). F: Тест за толерантност към глюкоза и AUC на 20-седмично женско потомство F1 (nCtrl-F1_NCD = 5, nINS-F1_NCD = 5, nGDM-F1_NCD = 6, nCtrl-F1_HFD = 5, nINS-F1_HFD = 6, nGDM-F1_HFD = 6). G: ITT в 20-седмично мъжко поколение F1 (nCtrl-F1_NCD = 6, nINS-F1_NCD = 8, nGDM-F1_NCD = 6, nCtrl-F1_HFD = 8, nINS-F1_HFD = 9, nGDM-F1_HFD = 10). H: ITT в 20-седмично женско потомство на F1 (nCtrl-F1_NCD = 5, nINS-F1_NCD = 6, nGDM-F1_NCD = 5, nCtrl-F1_HFD = 6, nINS-F1_HFD = 7, nGDM-F1_HFD = 8). Данните са изразени като средна стойност ± SEM. * P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Метаболитни параметри при потомство F1

Инсулиновата терапия - медиирана защита срещу непоносимост към глюкоза при потомството е премахната чрез експозиция на HFD в зряла възраст

Инсулиновата терапия за GDM доведе до ясно спасяване на непоносимостта към глюкоза при мъжки потомци INS-F1, само с повишаване на нивата на глюкоза след 60 минути след инжектирането (фиг. 1Е) Но поразително, HFD премахна тази защита (фиг. 1Е). Резултатите от ITT показаха, че само GDM-F1 мъжки мишки показват значително нарушена инсулинова чувствителност при стареене в групата с NCD (допълнителна фигура 2В и фигура 1G). Въпреки това, когато се предизвиква с HFD, не само мъжете от GDM-F1 развиват много по-сериозна непоносимост към инсулин, но мъжете от INS-F1 също показват изразено увреждане на инсулиновия толеранс в сравнение с контролите (фиг. 1G). При женски потомци само жени от GDM-F1 показват повишение на нивото на глюкозата на 30 и 120 минути след инжектирането на инсулин (фиг. 1Н).

Дефектите на секрецията на инсулин също могат да допринесат за непоносимост към глюкоза. Оценихме стимулирана с глюкоза секреция на инсулин (GSIS) in vivo и in vitro. In vivo, GSIS е намален както при мъжете, така и при жените GDM-F1 (фиг. 2A-D). В групата INS-F1 само мъжете показват по-ниски нива на инсулин в отговор на инжектирането на глюкоза (фиг. 2А и В). In vitro инсулиновият секреторен отговор на 5,6 mmol/L глюкоза е сходен сред всички групи (фиг. 2Е и F); въпреки това, островчета от GDM-F1 мъже или жени показват нарушена секреция на инсулин, когато са изложени на 16,7 mmol/L глюкоза (Фиг. 2E и F). Дефектен инсулинов отговор на висока глюкоза (16,7 mmol/L) също се наблюдава при мъже INS-F1 (фиг. 2Е). Не е открита значителна разлика при жените INS-F1 в глюкозния толеранс, инсулиновата чувствителност или GSIS (фиг. 1F и H и 2C, D и F).

Модели на метилиране на ДНК в панкреатичните островчета на мъжкото потомство. A: Топлинна карта на диференциално метилирани региони между Ctrl-F1 (C) и GDM-F1 (G), Ctrl-F1 (C) и INS-F1 (I). B: Разпределение на диференциално метилирани пикове в генома в G срещу C и I срещу C. C: Диаграма на Venn на хиперметилирани гени, припокрити между G срещу C и I срещу C. D: Диаграма на Venn на хипометилирани гени, припокрити между G срещу C и I срещу C. E: KEGG анализ на диференциално метилирани гени, свързани с диабет тип 2.

Анализът KEGG (Киото енциклопедия на гени и геноми) показа, че диференциално метилираните гени в GDM-F1 и INS-F1 кодират основно йонните канали в бета-клетките на островчета и участват в секрецията на инсулин. Тези гени, избрани за валидиране, са Abcc8 (кодиращ сулфонилурейния рецептор 1, Sur1, принадлежащ към ATP-свързваща касета суперсемейство на транспортери), Cacna1c (Cav1.2, кодиращ една субединица на L-тип Ca 2+ канали с широко разпространена експресия при мишка, плъх и човешки островчета β-клетки), Cacna1e (Cav2.3, кодиращ R-тип Ca 2+ канала и изразен в гризачи и хора), и Cacna1g (Cav3.1, кодиращ Т 2 тип Ca 2+ ток и главно експресиран при NOD мишка, плъх и човек) (Фиг. 3Е). MeDIP-seq данни показват, че тези кандидат-гени показват състояние на хиперметилиране в GDM и INS потомци в сравнение с контролите.

Инсулиновата терапия за GDM не възстанови променената експресия на йонните канали и дефектната секреция на инсулин в потомството на панкреатичните островчета

Нивата на тРНК и протеини на Abcc8, Cav1.2 и Cav2.3 бяха значително по-ниски при мъжете GDM-F1 и INS-F1 (Фиг. 4A-G). В допълнение, излагането на HFD понижава експресията на Cav1.2 във всички групи, но мъжете GDM-F1 и INS-F1 показват драстично намалена експресия на Cav1.2 след хранене с HFD (Фиг. 4B, D и F). Подобна промяна на генната експресия се наблюдава и при GDM-F1 жени (допълнителна фигура 3А-С). Но при жените INS-F1 само Cav2.3 показва намалена експресия (допълнителна фигура 3С). Няма значителна разлика в експресията на Cav3.1 между групите (данните не са показани).

Инсулиновата терапия за GDM не промени обратното състояние на метилиране на ДНК в Abcc8, Cav1.2 и Cav2.3 в потомството на панкреатичните островчета

Бяха изолирани панкреатични островчета на 20-седмично потомство и пиросеквенцията беше използвана за анализ на състоянието на метилиране на 10 цитозин фосфат гуанин (CpGs) на промотора Abcc8, CpGs на промотора Cav 1.2 и 11 CpGs на промотора Cav 2.3. CpGs на Abcc8, Cav1.2 и Cav2.3 показват значително по-висок статус на метилиране на ДНК в островчета от мъжки GDM-F1 и INS-F1 (Фиг. 5A-C). В сравнение с мъжете с GDM-F1, промененият статус на метилиране на ДНК в Cav1.2 и Cav2.3 е подобрен в различна степен при мъжете INS-F1 (фиг. 5B и C). Освен това установихме, че ефектът от лечението с GDM върху метилирането на ДНК в трите целеви гена със специфична за пола разлика (фиг. 5 и допълнителна фиг. 3). По-специално, майчиният гликемичен контрол е свързан с ясно възстановяване на нивата на метилиране на ДНК в Abcc8 и Cav1.2 при жени INS-F1 (допълнителни фигури 3D и E) и умерено хиперметилирано ниво в промоторни области на Cav2.3 (допълнителна фигура 3F ). В допълнение, храненето с HFD е причинило значително по-високо ниво на метилирано ДНК в промоторните области на Cav1.2 в GDM и INS потомство (фиг. 4В и допълнителна фиг. 3Е), но ефектът на HFD върху метилирането на ДНК не е открит при Abcc8 и Cav2 .3.

Фетални островчета експериментират in vitro. О: Схематично представяне на експериментален дизайн. B: Феталните островчета ex vivo се култивират за една нощ и се идентифицират чрез откриване на инсулин с имунофлуоресценция. Черна скала, 200 μm; бяла скала, 50 μm. C – E: Нива на експресия на целеви гени, гени на ДНК метилтрансфераза и гени на деметилтрансфераза във фетални островчета (n = 3 повторения на група и три независими изолации). F – H: Състояние на метилиране на Abcc8, Cav1.2 и Cav2.3 във фетални островчета, култивирани в среда, съдържаща посочена глюкоза (n = 3 повторения на група и две независими изолирания). Данните са изразени като средна стойност ± SEM. * Наблюдавани са P 2+ канали, които медиират секрецията на инсулин. Обаче женското потомство показва само по-високо метилиране на ДНК и по-ниска експресия на Cav2.3, което предполага, че поне в промоторните области на трите целеви гена епигенетичната модификация на мъжкия плод може да бъде по-чувствителна към вътрематочната хипергликемия от женската плод.

Освен това, in vitro културата потвърждава ефекта от краткото излагане на висока глюкоза върху експресията на гени Abcc8, Cav1.2 и Cav2.3 и метилирането на ДНК във феталните островчета. Нашият животински модел, заедно с in vitro културата, предоставя доказателства, че ранното развитие е чувствително към външните фактори (41) и че краткото излагане на вътрематочна хипергликемия е достатъчно, за да повлияе трайно на генната експресия на йонните канали и метилирането на ДНК. Въпреки че директното прехвърляне на нашите експериментални резултати в човешката ситуация изисква повишено внимание, важно е да се признае, че освобождаването от симптоми е една от основните трудности при GDM и бременната жена обикновено не знае, че има GDM, докато не бъде диагностицирана при рутинна пренатална бременност скрининг (42), предполагащ, че плодът може вече да е изложен на неблагоприятната вътрематочна среда и да проявява адаптивни промени в епигенома (43).

В допълнение, експериментът in vitro показа, че променената генна експресия на ДНК метилозаписващи и метил-изтриващи ензими се запазва по време на последваща нормална глюкозна култура, което показва, че други вредни фактори, индуцирани от хипергликемия, също могат да допринесат за трайните епигенетични промени. Майчината глюкоза може свободно да проникне през плацентата и глюкозните екскурзии не само причиняват фетална хипергликемия, но също така предизвикват фетална хиперинсулинемия и оксидативен стрес (44,45). Въпреки че инсулиновата терапия за GDM нормализира нивото на глюкоза в майчината кръв, дали инсулиновата намеса е обърнала други неблагоприятни фактори е неизвестно. Ако не, тези фактори могат да продължат да влияят върху развитието на плода и епигенетичните модификации (45).

Условията в постнаталната среда също са важни сигнали за предизвикване на метаболитни заболявания при възрастни (46). В нашето проучване излагането на HFD изостри непоносимостта към глюкоза. Но най-важното е, че това индуцирано от HFD преддиабетно състояние при GDM потомство, независимо дали е с инсулинова терапия или не, е по-тежко от наблюдаваното при контролно потомство, което предполага, че ранната фетална инсулт може да наруши способността за адаптиране към HFD. Вътрешните фактори също могат да повлияят на епигенома след раждането (46–48). Постоянно установяваме, че HFD причинява по-високо ниво на метилиране на ДНК на Cav1.2. Въпреки това, в сравнение с контролното потомство, пре- и постнаталните фактори действат синергично, за да индуцират по-значимо хиперметилирано ниво на Cav1.2 в потомството с инсулинова терапия за GDM, което може отчасти да допринесе за влошената глюкозна непоносимост след излагане на HFD.

Допълнителен фактор, който може да бъде отговорен за обострената глюкозна непоносимост, е инсулиновата резистентност. Дефектната секреция и действие на инсулина са два основни резултата от диабета (49,50). Забележително е, че дори при инсулинова терапия за GDM, инсулиновата резистентност възниква, когато потомството се предизвиква с HFD в зряла възраст. Въпреки че основните механизми все още са неизвестни, интересно е да се отбележи, че тези потомци в групата с HFD показват значителни затлъстели фенотипове, което предполага, че инсулиновата резистентност може да бъде свързана с нарушения в наднорменото тегло и липидния метаболизъм.

Информация за статия

Финансиране. Тази работа беше подкрепена от Специалния фонд за безвъзмездната помощ за Националния план за научни изследвания и развитие (№ 2017YFC1001300), Националната фондация за естествени науки на Китай (№ 31671569, № 81490742, № 31471405 и № 31571556), Общинска програма за развитие на човешките ресурси за изключителни млади таланти в медицинските и здравни науки в Шанхай (№ 2017YQ047) и фондовете за фундаментални изследвания за централните университети.

Двойственост на интересите. Не са докладвани потенциални конфликти на интереси, свързани с тази статия.