Резюме

Алергичният контактен дерматит (ACD) се задейства от аберрантен хипервъзпалителен имунен отговор на безвредни химични съединения и се нарежда като най-разпространеното професионално състояние на кожата в света. Въпреки че различни имунни ефекторни клетки се активират по време на ACD, регулаторните Т (Treg) клетки са от решаващо значение за контролиране на произтичащото възпаление. Инсулиноподобният растежен фактор-1 (IGF-1) регулира клетъчната пролиферация и диференциация и ускорява зарастването и регенерацията на рани в няколко органа, включително кожата. Наскоро IGF-1 също е замесен в защита от автоимунно възпаление чрез разширяване на Treg клетките. Тук демонстрираме, че ектопичната експресия на IGF-1 в кожата на мишка потиска ACD по специфичен за Treg клетки начин, увеличавайки броя на клетките Foxp3 + Treg в засегнатата област и стимулирайки производството на лимфоцити на противовъзпалителния цитокин интерлевкин 10. Подобно терапевтичните ефекти могат да бъдат постигнати със системно или локално доставяне на IGF-1, което предполага този растежен фактор като обещаваща нова терапевтична възможност за лечение на ACD.

растежен

ВЪВЕДЕНИЕ

Алергичният контактен дерматит (ACD) е често срещано възпалително състояние на кожата, предизвикано от излагане на често срещани агенти на околната среда, включително метали, козметика, лекарства и растителен материал. Клиничните симптоми на ACD включват сърбеж с еритема, везикули и мехури по време на остра фаза и пукнатини и пукнатини в хроничната фаза (Usatine и Riojas, 2010). ACD може да окаже значително влияние върху качеството на живот на засегнатите лица в допълнение към значително социално-икономическо въздействие (Kimber et al., 2002; Ale и Maibacht, 2010). Познаването на молекулярните механизми и патофизиологията на ACD е получено главно от животински модели на контактна свръхчувствителност (CHS), при които възпалението на кожата се предизвиква чрез боядисване на кожата с хаптени като 2,4-динитрофлуорбензол (DNFB) (Simonetta and Bourgeois, 2011 ). CHS се развива в два етапа: индукция или сенсибилизация и последваща фаза на извличане. В етапа на сенсибилизация хаптените проникват в кожата и предизвикват вроден имунен отговор, който води до грундиране на хаптен-специфични Т-клетки, причинявайки сенсибилизация, така че всяко последващо излагане на първоначалния хаптен предизвиква енергичен вторичен имунен отговор в точката на контакт. При хората това завършва с кожната възпалителна реакция, определена клинично като ACD (Kimber et al., 2002; Kaplan et al., 2012; Vocanson et al., 2009).

Регулаторните Т (Treg) клетки са мощни супресори на възпалителните реакции и са от решаващо значение за поддържането на имунологичната хомеостаза и самотолерантност (Sakaguchi et al., 2010; Geiger and Tauro, 2012; Lehtimäki and Lahesmaa, 2013). Намаленият брой Treg клетки или анормалните функции на Treg клетки са замесени в различни хипервъзпалителни състояния, а терапиите, които възстановяват или увеличават броя на Treg клетките, показват благоприятни ефекти в експериментални условия, както и при хора (Jäger и Kuchroo, 2010; Huang и Sattler, 2011). Трег клетките също играят важна роля в контрола и разрешаването на възпалителния отговор по време на CHS. Изчерпването на Treg клетки причинява засилено и продължително подуване на ушите (Tomura et al., 2010), докато приемният трансфер на Treg клетки може да потисне инфилтрацията на имунните клетки и подуването на ушите, ефект, медииран предимно от освобождаването на имуносупресивния цитокин интерлевкин (IL) - 10 (Ring et al., 2009).

Пептидният хормон инсулиноподобен растежен фактор-1 (IGF-1) е основен регулатор на оцеляването, растежа и диференциацията, ускорява заздравяването на рани и засилва регенеративните процеси в различни органи и тъкани, включително кожата (Semenova et al., 2008). В съответствие с често срещаните кръстосани разговори между ендокринната и имунната система, е доказано, че IGF-1 подобрява автоимунните състояния (Liu et al., 1997; Lovett-Racke et al., 1998; Smith, 2010). Anguela и колеги съобщават, че IGF-1 е защитен по време на автоимунен диабет, корелиращ с повишен процент на Treg клетки в черния дроб (Anguela et al., 2013), а наскоро демонстрирахме директно стимулиране на локалната пролиферация на Treg клетки от системен IGF-1 терапия при множество автоимунни нарушения (DB, BJ, NR et al., непубликувано).

За да проверим хипотезата, че IGF-1-медиираното разширяване на клетките Treg също е от полза при неавтоимунни възпалителни състояния, индуцирахме CHS при мишки, които или свръхекспресираха трансгенния IGF-1Ea пропептид в кожата (K14/IGF-1Ea) или бяха лекувани с рекомбинантен човешки IGF-1 (rhIGF-1) протеин чрез системно или локално приложение за оценка на терапевтичното значение. Ние документираме намалено възпаление чрез подуване на ухото, хистология, експресия на цитокини и брой Treg клетки и потвърждаваме директен ефект на IGF-1 върху Treg клетки чрез условно генетично делеция на IGF-1 рецептора (IGF-1R). Зависимата от клетките Treg клинична полза от IGF-1 в този модел предлага както механистично прозрение за ACD, така и клинично значима стратегия за терапевтично приложение.

ПРЕВОДНО ВЪЗДЕЙСТВИЕ

Клиничен въпрос

Алергичният контактен дерматит (ACD) е възпалително състояние на кожата, причинено от контакт с обичайни агенти на околната среда, към които засегнатото лице е било сенсибилизирано по време на предишно излагане. ACD се нарежда като най-разпространеното професионално състояние на кожата в света, има значително социално-икономическо въздействие и значително влияе върху качеството на живот на засегнатите лица. Клиничните симптоми включват сърбеж на кожата с еритем (зачервяване), везикули и мехури по време на острата фаза и кожни пукнатини и пукнатини в хроничната фаза. Въпреки че точните механизми, лежащи в основата на патологията на ACD, остават неясни, известно е, че различни имунни клетки се активират по време на ACD и неуспехът на специфична подгрупа от имунни клетки (регулаторни Т клетки) да контролират полученото възпаление е основен фактор, допринасящ за патологията. Напоследък инсулиноподобният растежен фактор-1 (IGF-1) е замесен в предоставянето на защита на други форми на хипер-възпалителни състояния чрез стимулиране на регулаторните Т-клетки. Настоящото проучване се стреми да определи дали IGF-1 е ефективен при потискане на симптомите на контактна свръхчувствителност (CHS), като се използва миши модел на ACD.

Резултати

За да се изследва ефектът на IGF-1 върху симптомите на CHS, CHS се индуцира в трансгенни мишки, екктолно експресиращи IGF-1 в кожни клетки. Тези мишки показаха поразително намаляване на възпалителния отговор и клиничните симптоми на CHS. Подобни терапевтични ефекти могат да бъдат постигнати или със системно доставяне на IGF-1 чрез имплантирани осмотични минипомпи, или с локално третиране на засегнатата област на кожата с хидрогел, съдържащ IGF-1. Потискането на възпалението и благоприятния клиничен резултат корелира с увеличаване на регулаторния брой на Т-клетките и повишено производство на противовъзпалителни цитокини в засегнатата област на кожата. Най-важното е, че тежестта на симптомите на CHS при мишки без липса на IGF-1 рецептор, специфично за регулаторните Т клетки, не се подобрява след лечение с IGF-1. Това категорично показва, че благоприятните ефекти на IGF-1 се медиират от директна стимулация на регулаторните Т клетки.

Последици и бъдещи указания

Това проучване показва за първи път, че IGF-1 директно стимулира разширяването на регулаторните Т клетки и е в състояние да потисне патологичната възпалителна реакция по време на контактна свръхчувствителност. Резултатите от това проучване включват този растежен фактор като обещаваща нова терапевтична възможност за лечение на ACD. В допълнение, поради широкия си ефект върху регулаторното разширяване на Т-клетките, приложението на IGF-1 може също да има терапевтичен потенциал при пациенти с други остри възпалителни състояния, което води до по-нататъшно тестване на неговата обща ефективност при възпалителни разстройства.

РЕЗУЛТАТИ

Свръхекспресията на IGF-1Ea пропептид в кожата намалява тежестта на контактните реакции на свръхчувствителност

Аблацията на IGF-1R в Treg клетки отменя терапевтичния ефект на IGF-1

За да се изследва дали наблюдаваният супресивен ефект на локалния IGF-1Ea пропептид върху CHS в кожата е пряк и зависим от клетките Treg, мишките K14/IGF-1Ea са кръстосани с мишки, приютяващи специфично за Treg клетки IGF-1R условно делетиране (IGF- 1R CKO: Foxp3 Cre × Igf1r fl/fl). Въпреки че възпроизводими и статистически значими, супресивните ефекти на IGF-1Ea изглеждаха намалени при тези мишки, потенциално поради различия в генетичния фон, които налагаха използването на различни дози за индукция на CHS, за да се получат сравними реакции на подуване на ухото (допълнителен материал Фиг. S2). Интересното е, че значителният терапевтичен ефект на свръхекспресията на IGF-1Ea върху тежестта на реакцията на свръхчувствителност при контакт е загубен при IGF-1R CKO мишки, които развиват CHS реакции на подуване на ушите, сравними с мишки от див тип (Фиг. 3). По този начин тези резултати показват, че IGF-1R-медиираната сигнализация в Treg клетките е необходима за имуносупресивния ефект на IGF-1Ea по време на контактна свръхчувствителност и потвърждават, че тази регулаторна клетъчна популация е необходима за наблюдавания IGF-1-зависим благоприятен ефект по време на това остър възпалителен отговор.

Контактна свръхчувствителност

Терапевтични възможности за доставка на rhIGF-1

Системното доставяне на rhIGF-1 беше постигнато чрез непрекъснато освобождаване на rhIGF-1 (Cambridge Biosciences, Milpitas, CA) при 0,25 μl/час от осмотична минипомпа Alzet (модел # 2004, Alzet Osmotic Pumps, Cupertino, CA) в доза от 0,275 mg/kg/ден. Минипомпите бяха имплантирани в кожен джоб под кожата на гърба под обща анестезия. Локалното лечение с rhIGF-1 се извършва чрез прилагане на 30 μl хидрогел, съдържащ 100 μg/ml rhIGF-1, на едно ухо 3 дни преди и 2 дни след предизвикване на CHS отговор.

Изолация на имунните клетки от кожата

Върховете на външното ухо на мишката бяха събрани и разделени на гръбни и вентрални листчета. За да се осигури стандартизирано вземане на проби и еднакви размери на пробите, ушите бяха изрязани точно над областта на хрущяла на външното ухо. За фиг. 2А беше изрязано парче 2 cm 2 оспорена кожа от задния торс. Подкожната тъкан се остъргва и кожата се смила фино и се смила с 0,25% колагеназа F (Sigma-Aldrich, Dorset, UK) за 30 минути при 37 ° C. След това усвоените тъканни парчета се намачкват през сито от 70 μm, за да се генерира суспензия от една клетка. Клетъчната смес се използва директно за поточен цитометричен анализ на инфилтриращи кожата клетки или допълнително се обработва за изолиране на CD45 + или CD4 + клетки чрез FACS сортиране. За in vitro експерименти със стимулиране на IGF-1 бяха използвани мишки Foxp3EGFP и популацията CD4 беше сортирана по FACS в популации CD4 + GFP + (общо CD4) и CD4 + GFP - (изчерпани CD4 на Treg клетки). Сортирането по FACS се извършва с помощта на FACS Aria или FACS Aria SORP (Becton Dickinson, Oxford, UK, 70 μm дюза, 70 psi;> 98% чистота).

Поточен цитометричен анализ

Антитела срещу CD45 (клон 30-F11), CD3 (клон 17A2), CD4 (клон GK1.5), CD25 (клон PC61.5), CD127 (клон A7R34), Foxp3 (клон FJK-16F), Ki67 (клон 16A8 ), IL-10 (клон JES5-16E3) и TGF-β (клон TW7-16B4) са закупени от BioLegend (BioLegend, Лондон, Великобритания). Повърхностните и вътреклетъчните оцветявания бяха извършени съгласно протокола на производителя. За оцветяване с цитокини клетките се инкубират в продължение на 4 часа с РМА/Йономицин (Sigma-Aldrich, Dorset, UK) в присъствието на GolgiStop (BD Biosciences, Оксфорд, Великобритания), съгласно инструкциите на производителя. За да се проследи потенциалната миграция на Treg клетки в кожата, кръвните клетки бяха маркирани in situ с CFSE чрез инжектиране на мишки с 2 μg CFSE/10 μl/g телесно тегло за период от 5 минути през вената на опашката (Becker et al., 2004) . Пробите бяха получени с помощта на BD LSRII (Becton Dickinson, Oxford, UK) и анализирани с помощта на софтуера FlowJo (Treestar, Ashland, OR). Общата стратегия за затваряне, използвана за анализ, е показана в допълнителен материал Фиг. S1.

Клетъчна култура

Първични имунни клетки, изолирани от кожата на ухото или далака, са култивирани в среда RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT, USA), съдържаща 2 mM L-глутамин, 10% фетален говежди серум (Sigma-Aldrich, Dorset, UK), 100 U/ml стрептомицин и 100 U/ml пеницилин (Hyclone, Logan, UT) при 37 ° C в 5% CO2 атмосфера. За експерименти с IGF-1 клетките се стимулират с rhIGF-1 при концентрации 25 и 100 ng/ml в продължение на 48 часа и се обработват допълнително за поточно цитометрично оцветяване на експресията на Foxp3. За да се открие пролиферацията в някои експерименти, клетките бяха маркирани с eFluor780 (eBioscience, Hatfield, UK) преди култивиране, съгласно инструкциите на производителя. За вътреклетъчно оцветяване с цитокини клетките се стимулират в продължение на 4 часа с 50 ng/ml PMA и 500 ng/ml йономицин (Sigma-Aldrich, Dorset, UK) в присъствието на GolgiStop (BD Biosciences, Оксфорд, Великобритания) съгласно инструкциите на производителя . За ELISA клетките бяха стимулирани с 50 ng/ml PMA и 500 ng/ml йономицин в продължение на 24 часа.

ELISA

CD45 + клетките бяха сортирани по FACS от третираната с CHS кожа и стимулирани с РМА и йономицин в продължение на 24 часа. Супернатантите на клетъчните култури бяха събрани и използвани за откриване на секретиран IL-10 и TGF-β. LEGEND MAX ™ мишка IL-10/TGF-β1 ELISA комплекти (BioLegend, Лондон, Великобритания) бяха използвани в съответствие с инструкциите на производителя.

Изолация на РНК и количествена PCR

РНК се изолира от CD45 + CD3 + CD4 + Т клетки, получени чрез FACS сортиране от едноклетъчни суспензии на колагеназна F-смилана кожа на гърба с помощта на RNeasy Mini Kit съгласно инструкциите на производителя (Qiagen, Manchester, UK). Общо изолирана РНК се използва за синтез на cDNA, като се използва система за синтез на първа верига SuperScript за RT-PCR (Life Technologies, Монца, Италия) съгласно инструкциите на производителя. Количественият РНК анализ беше извършен чрез PCR в реално време, използвайки сонди Taqman (Life Technologies, Монца, Италия) срещу IL-10 и Foxp3. Количествата на иРНК бяха нормализирани до нивата на гена hprt, който беше използван като вътрешен контрол.

Хистология

Ушните уши от третирани с CHS и нетретирани мишки бяха изрязани и фиксирани в 4% формалдехид за една нощ, дехидратирани в нарастващ градиент на етанол и вградени в парафин. Секции от 5 μm бяха изрязани и след това обезпарафинирани и рехидратирани в етанолов градиент. Срезите бяха оцветени с хематоксилин и еозин (H&E). Всички реактиви са закупени от Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Dorset, UK). Изображенията бяха заснети с помощта на микроскоп LMD7000 (Leica Microsystems, Milton Keynes, UK) и количествено измервани с помощта на публичния софтуер ImageJ (NIH; http://rsb.info.nih.gov) (Schneider et al., 2012).

Статистика

Статистическите анализи бяха извършени с помощта на GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA), като се използва едно- или двустранен t-тест, както е подходящо.

Благодарности

Благодарни сме на Филип Авнер (EMBL Monterotondo) за частична финансова подкрепа на B.J .; на д-р Jian Guo Chai за предоставяне на линията на мишката Foxp3EGFP; на членовете на лабораторията Розентал за полезни дискусии; и на персонал в съоръженията за животни в Harefield Heart Science Center, Imperial College London и EMBL Monterotondo за помощ при отглеждането и поддържането на животни.

Бележки под линия

Конкуриращи се интереси

Авторите не декларират конкуриращи се финансови интереси.