Резюме

1. Въведение

Затлъстяването е основен проблем на общественото здраве в световен мащаб и е свързано с епигенетичните фактори, прекомерната консумация на преработена храна, богата на мазнини и захар, и липсата на физическа активност, наред с други фактори. Световната здравна организация (СЗО) определя наднорменото тегло и затлъстяването като необичайно или прекомерно натрупване на мазнини, които допринасят за развитието на други заболявания, като захарен диабет, хипертония и бъбречни или коронарни проблеми [1,2].

Енергийният метаболизъм се определя от енергийните разходи и приема на храна, които трябва да бъдат балансирани за поддържане на телесното тегло. Скелетните мускули са прицелен орган в контекста на клетъчната биоенергетика поради важната му роля в глюкозната хомеостаза и инсулиновата чувствителност [3,4]. По този начин е обичайно, че затлъстелите лица, които обикновено показват увеличаване на телесната мастна маса и намаляване на масата без мазнини, имат намаляване на енергийните разходи.

Активираният от пероксизомен пролифератор гама коактиватор 1-алфа (Pgc1α) е отговорен за регулирането на биогенезата на митохондриите, консумацията на кислород и окислителното фосфорилиране чрез увеличаване на масата на митохондриите, активиране на няколко ключови компонента на адаптивната термогенеза и стимулиране на усвояването на енергия, което позволява адаптиране на клетките и тъканите към ситуации с високи енергийни нужди [5]. Pgc-1α се регулира чрез посттранслационна модификация, включително фосфорилиране и деацетилиране чрез протеин киназа, AMP-активиран (Ampk) и сиртуин 1 (Sirt1), съответно [6]. Тези три гена съставят енергочувствителна мрежа, която контролира енергийните разходи в скелетните мускули [7].

Разработени са няколко стратегии за контрол на затлъстяването и широко използвани функционални храни и/или биоактивни съединения с термогенни ефекти. Зеленият чай е свързан със загуба на тегло и модулация на енергийните разходи и метаболизма на мазнините [8]. Консумацията на куркумин, член на семейство джинджифил, увеличава термогенната генна експресия (като разединяване на протеин 1 (Ucp1) и Pgc1a) и увеличава съдържанието на митохондрии в ингвиналната бяла мастна тъкан [9]. В допълнение, при мишки C57BL6, хранени с HFD и лутеолин, естествен флавоноид, богат на пипер, целина, мащерка, мента и орлови нокти, се наблюдава увеличаване на консумацията на кислород, както и по-високо производство на въглероден диоксид и съотношение на дихателен обмен [10]. Освен това, ресвератролът успява да намали оксидативния стрес, възстановявайки функционалните дейности на митохондриите и стимулирайки окислителното фосфорилиране и експресията на гена на митохондриалната биогенеза при мишки, хранени с високо съдържание на мазнини [11,12].

Гуарана (Paullinia cupana Kunth) е свързана със загуба на тегло, показвайки няколко защитни действия срещу хипертония, затлъстяване и метаболитен синдром [13], способността да намали приема на храна [14] и да модулира гени, свързани с адипогенезата [15]. Освен това вече е демонстрирано, че смес от екстракт от гуарана и зелен чай, съдържаща фиксирана доза кофеин (200 mg) и променливи дози епигалокатехин-3-галат (EGCG), увеличава енергийните разходи (измерени в метаболитна камера за измерване 24 часа енергийни разходи) при здрави възрастни [16]. По този начин целта на нашето проучване е да изследва ефектите и потенциалните механизми, залегнали в ефектите на пероралното лечение с гуарана върху затлъстяването, метаболизма и митохондриалната биогенеза.

2. Материал и методи

2.1. Експериментален дизайн

маса 1

Диетичен състав с високо съдържание на мазнини.

Състав Високомаслена диетаg kg -1 ккал kg -1
Царевично нишесте115.5462
Казеин200800
Захароза100400
Декстринирано нишесте132528
Свинска мас3122808
Соево масло40360
Целулоза50-
Минерален микс35-
Витаминен микс10-
л -цистин 3-
Холин2.5-
ОБЩА СУМА10005358

2.2. Непряка калориметрия

Основният енергиен разход на животните се оценява чрез непряка калориметрия. Четиридесет и осем часа преди евтаназия, мишките се аклиматизират за 24 часа в отделни метаболитни клетки (система OXYLET - за гризачи) и се наблюдават още 24 часа. Количеството консумиран O2 (VO2) и произведеното количество CO2 (VCO2) се измерват на интервали от 25 минути в продължение на 24 часа. Дихателната скорост на обмен (RER) се изчислява, като се използва следната формула: (RER) = VCO2/VO2. Основните енергийни разходи (EE) се определят по следната формула: kcal/ден/kg 0,75 = 1,44 × VO2 × (3815 + 1232 × RER) [17].

2.3. Процедура с животни и дисекция на тъкани

Приемът на храна и телесното тегло се измерват ежеседмично. Нивата на гликемия, триглицериди и холестерол се определят от Accutrend Plus (Roche Diagnostics GmbH, Манхайм, Германия) с помощта на специфични ленти. В края на 8 седмици мишките се анестезират (след 12 часа на гладно) с 1: 1 разтвор на 2% ксилазин/10% кетамин (1 μL/g телесно тегло) и кръвни проби се събират чрез сърдечна пункция. Депата на мастната тъкан (подкожна, ретроперитонеална, висцерална и епидидимална) бяха дисектирани и претеглени. Проби от мускули на гастрокнемиус и кафява мастна тъкан се дисектират и съхраняват при -80 ° C до анализ.

2.4. Анализ на експресията на mRNA (Messenger Robonucleic Acid)

Мускулни проби бяха използвани за количествен PCR анализ в реално време. Цялостна екстракция на РНК, синтез на комплементарна ДНК (cDNA) и количествена PCR се извършват, както е описано по-рано [18], като се използват специфични праймери (Таблица 2). Първо, всички проби бяха нормализирани с помощта на домакински 18S ген и след това, HFD-GUA групата беше нормализирана от HFD група. Уравнението 2 −ΔΔCt беше използвано за изчисляване на промяната на сгъването.

Таблица 2

Грундове, използвани за PCR в реално време.

GenePrimerSequence (5 ′ → 3 ′)
Sirt1СмисълAGTGGCACATGCCAGAGTC
АнтисенсTCCAGATCCTCCAGCACAAT
Креб1СмисълTTTGTCCTTGCTTTCCGAAT
АнтисенсCACTTTGGCTGGACATCTTG
Ampka1СмисълTGAGAACGTCCTGCTTGAATG
АнтисенсATCATTGGCTGAGCCACAGC
Ampka2СмисълACAGGCCATAAAGTGGCAGT
АнтисенсGTCGGAGTGCTGATCACGTG
Pgc1αСмисълCCGAGAATTCATGGAGCAAT
АнтисенсTTTCTGTGGGTTTGGTGTGA
Nrf1СмисълCAACAGGGAAGAAACGGAAA
АнтисенсCACTCGCGTCGTGTACTCAT
Nrf2СмисълAGGACATGGAGCAAGTTTGG
АнтисенсTCTGTCAGTGTGGCTTCTGG
Ucp1СмисълTCAGGGCTGAGTCCTTTTGT
АнтисенсCTGAAACTCCGGCTGAGAAG
Ucp3СмисълCTCACTTTTCCCCTGGACAC
АнтисенсGTCAGGATGGTACCCAGCAC
18SСмисълAAACGGCTACCACATCCAAG
АнтисенсCAATTACAGGGCCTCGAAAG

2.5. Количествено определяне на митохондриална ДНК (Mtdna)

Количественото определяне на митохондриалната ДНК (mtDNA) се извършва чрез количествена PCR в реално време. Накратко, ДНК (дезоксирибонуклеинова киселина) екстракция (от мускулна и кафява мастна тъкан) се извършва с помощта на фенол/хлороформ метод. След това се извърши PCR в реално време, като се използва Platinum ® SYBR GREEN ® qPCR Supermix Uracil-DNA-glycosylase (UDG) (Invitrogen, CA, USA) съгласно протокола на производителя. За количествено определяне на mtDNA използвахме митохондриален Cox1 (субединица I на цитохром c оксидаза) (FW 5′-GCCCCAGATATAGCATTCCC-3 ′ и RV 5′-GTTCATCCTGTTCCTGCTCC-3 ′) и като ендогенен контрол, 18S rRNAAG TTC 5G-TGG ′ И RV 5′-CGCTGAGCCAGTCAGTGT-3 ′). PCR в реално време се извършва в система за PCR в реално време от 7500 (Applied Biosystems Foster City, Калифорния, САЩ) и се анализира с помощта на RQ Study Software (Applied Biosystems). Относителното количествено определяне на mtDNA копия се получава чрез съотношението DNAmt/ядрена ДНК и след нормализиране с домакински ген 18S, промяната на гънките се определя, като се използва уравнението: 2 −ΔΔCt метод.

2.6. Анализ на Western Blotting

2.7. Статистически анализ

Данните са представени като средни стойности ± SEM. GraphPad Prism 5 е използван за статистически анализи и графики (GraphPad Software, Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ). Експерименталните данни бяха анализирани чрез несдвоен t тест на Student. За анализ на телесното тегло е използван двупосочен вариационен анализ (ANOVA).

3. Резултати и дискусия

По-рано са показани ефектите на екстракта от гуарана (Paullinia cupana) върху контрола на телесното тегло, приема на храна, защитата срещу хипертония и върху модулацията на някои гени и miRNAs, свързани с процеса на адипогенеза [13,14,15]. В допълнение, в това проучване беше демонстрирано, че гуарана може да контролира телесното тегло чрез засилване на термогенезата и митохондриалната биогенеза.

биогенеза

(A) Телесно тегло (g) на диета с високо съдържание на мазнини (HFD) (n = 6) и диета с високо съдържание на мазнини + група Guarana (HFD-GUA) (n = 6) по време на осем седмици лечение; (Б.) Прием на храна (g) от HFD-група (n = 6) и HFD-GUA група (n = 6) през осем седмици лечение; (° С) Депа на мастната тъкан (g) на Подкожна мастна тъкан, Retro - ретроперитонеална мастна тъкан, Visc - висцерална мастна тъкан и Epi - епидидимална мастна тъкан след осем седмици лечение; (д) Гликемия (mg/dL) след 12 часа на гладно; (Е.) Триглицериди (mg/dL) след 12 часа на гладно; (F) Холестерол (mg/dL) след 12 часа на гладно. Черната линия/ленти съответстват на HFD-група (n = 6), а сивата линия/ленти съответстват на HFD-GUA група (n = 6). * p Фигура 2 A), както и EE (+ 20% в светлинния цикъл и + 16% в тъмния цикъл, p Фигура 2 B, C) в сравнение с HFD групата. Въпреки мишките, представящи нощна активност, възможно е основното увеличение на ЕЕ в светлинния цикъл (+ 20%) да се дължи на измерването, което се извършва по време на този цикъл, а не в тъмния цикъл. Освен това се изчислява коефициентът на дихателен обмен (RER), за да се определи дали преобладаващият източник на гориво е въглехидрати или мазнини. Известно е, че RER от 0,70 показва преобладаващо окисляване на мазнините; RER от 0,85 предполага комбинация от мазнини и въглехидрати, а стойност 1,00 или по-висока предполага намеса за окисляване на въглехидратите [21,22]. Нашите данни показват намаляване на RER в светлинния цикъл главно след сонда (Фигура 2 D) в групата HFD-GUA в сравнение с групата HFD (Фигура 2 E), което показва повишено използване на мастни киселини при животни, лекувани с гуарана. Въпреки това, не наблюдаваме разлика в RER в тъмния цикъл (Фигура 2 F). Съответно екстрактът от гуарана, консумиран заедно със зелен чай и EGCG, успява да увеличи енергийните разходи (измерени в метаболитна камера за измерване на енергийните разходи за 24 часа) при здрави възрастни [16]. Известно е, че гуарана има висока концентрация на кофеин [15,23] и някои проучвания вече са показали, че кофеинът е способен да модулира метаболизма и енергийните разходи [24,25,26].