Молекулярен вроден имунитет

Тази статия е част от изследователската тема

Индуцирана от нано и микрочастици клетъчна смърт, възпаление и имунни отговори Вижте всички 21 статии

Редактиран от
Удай Кишор

Университет Брунел, Лондон, Великобритания

Прегледан от
Любка Т. Руменина

INSERM U1138 Center de Recherche des Cordeliers (CRC), Франция

Робърт Б. Сим

Университет в Оксфорд, Великобритания

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

дългият

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Nephrologisches Zentrum, Medizinische Klinik und Poliklinik IV, Klinikum der Universität München, Мюнхен, Германия
  • 2 Катедра по нефрология, Институт по патология, RWTH университет в Аахен, Аахен, Германия
  • 3 DWI-Лайбниц институт за интерактивни материали, Аахен, Германия
  • 4 Отдел по възпаление и имунология, Клинично-изследователски център на Хуманитас, Роцано, Италия
  • 5 Департамент по биомедицински науки, Университет Хуманитас, Пиеве Емануеле, Италия

Въведение

Пентраксините са имунорегулаторни протеини с остра фаза, индуцирани при нарушаване на хомеостазата (1). Кратките пентраксини, С-реактивният протеин и серумният амилоид Р се синтезират в хепатоцитите в отговор на IL-6. С-реактивният протеин и серумният амилоид P действат като опсонини, свързващи се с редица микроорганизми, мъртви клетки и други частици, за да улеснят убиването или фагоцитозата, медиирано от комплемента (2). За разлика от късите пентраксини, дългият пентраксин PTX3 се произвежда локално и се освобождава в страни на инфекция и възпаление от няколко имунни и неимунни клетки, включително неутрофили, макрофаги, миелоидни дендритни, ендотелни и епителни клетки в отговор на възпалителни цитокини (т.е., IL-1β и TNF-α) и Toll-подобни рецепторни агонисти (3, 4). Важно е, че експресията на PTX3 е документирана в миши уроепител по време на уропатогенен Е. coli (UPEC) инфекции, където засилва фагоцитозата на UPEC от вродени имунни клетки (5). В действителност, сред многобройните имунорегулаторни функции на този пентраксин, разпознаването на извънклетъчните частици (т.е. микробни части) и насърчаването на тяхната фагоцитоза от макрофаги, неутрофили и дендритни клетки са основни опсонични дейности (6–10).

Серумни протеини, като албумин, както и плазмени фракции, съдържащи алфа-глобулини и бета-глобулини инхибират CaOx кристалната агрегация чрез различни механизми (31, 32). Наскоро забелязахме, че хуморалният имунен ефектор и опсонин имуноглобулин G инхибират растежа на кристалите CaOx инвитро (33). Поради високото си молекулно тегло нито албуминът, нито IgG преминават филтрационната бариера и следователно не са съставни части на гломерулния ултрафилтрат или урина при здрави индивиди и образуващи камъни. Поради това предположихме, че опсонин, като PTX3, който вероятно се експресира от тубуларни епителни клетки (т.е. отвъд бъбречната филтрационна бариера) и следователно директно освободен в урината (5), може да действа като ендогенен инхибитор на CaOx кристала агрегация вътре в бъбречните тубули. По този начин PTX3 може да ограничи нефрокалцинозата по време на хипероксалурия, хипотеза, подкрепена от доказателствата, представени и обсъдени в това проучване.

Резултати

Рекомбинантен човешки PTX3 инхибира индуцирана от пренасищане CaOx кристална агрегация

За изследванията на ХБН - освен уникалните патомеханизми, открити само в кристалопатиите - щамът и зависимостта от пола на модела посочват, че изследователите трябва да прилагат голямо внимание при използване на генетично модифицирани организми, които са генерирани от различни среди или не са напълно кръстосани. Също така, това важи не само за индуцирана от хипероксалурия нефрокалциноза, но и за редица други бъбречни възпалителни модели и състояния, например индуциран от тиогликолат перитонит (58), възпалителен отговор и албуминурия в отговор на претоварване с албумин (59), анти-GBM глумерулонефрит (60), както и отговор на нефротоксини (61).

В обобщение, опсонинът и имунният регулатор PTX3 също модулират CaOx кристалната агрегация и адхезията към тръбните клетъчни мембрани и следователно е един от няколкото ендогенни инхибитори на образуването на камъни при нефрокалциноза и потенциално при уролитиаза или други кристалопатии.

Материали и методи

Изследвания върху животни

BALB/c, C57BL/6N и CD-1 мишки са закупени от Charles River Laboratories (Sulzfeld, Германия). Ptx3-дефицитни мишки в B6; 129 фона са получени от Alberto Mantovani/Charles River Italy и са генерирани, както е описано по-рано (62). Мишките бяха настанени на групи от по пет във филтърни клетки с неограничен достъп до храна и вода. Клетките, гнездата, храната и водата бяха стерилизирани чрез автоклавиране преди употреба. За експерименти са използвани мъжки мишки на възраст от осем до дванадесет седмици. Оксалатната диета се приготвя чрез добавяне на 50 μmol/g натриев оксалат към стандартна диета без калций (Ssniff, Soest, Германия), както е описано по-рано (43, 63). Мишките се умъртвяват на 7, 14 и 21 ден след започване на диетата с оксалат. Бяха събрани проби от плазма и урина и GFR беше измерен в различни времеви точки преди цервикална дислокация. Урината незабавно се подкиселява за оценки на оксалатите или се центрофугира в продължение на 10 минути при 10 000 g за отстраняване на клетъчни компоненти и се съхранява при -80 ° C. Една част от всеки бъбрек беше фиксирана във формалин и впоследствие вградена в парафин за хистологичен анализ. Всички експериментални процедури са одобрени от местните власти.

Оценка на бъбречно увреждане

Бъбречните участъци от 2 μm се оцветяват с периодичен реагент на киселина-Шиф (PAS) и тубулното увреждане се оценява чрез оценка на процента на некротичните тубули и наличието на тръбни отливки. Оцветяването на Pizzolato се използва за визуализиране на кристали CaOx и образуването на кристални отлагания в бъбреците се оценява, както е описано (43). Фиброзните области бяха идентифицирани чрез имунооцветяване за αSMA (Dako GmbH, Германия) и колаген I (Abcam, Cambridge, UK). Експресията на кристални адхезионни молекули, напр. CD44 и анексин II, се идентифицира чрез имунооцветяване за CD44 и анексин II (и двете Abcam, Cambridge, UK). Експресията на PTX3 е идентифицирана в проби с фиксирана с параформалдехид и крио-нарязана тъкан проба с използване на поликлонално заешко анти-човешко PTX3 антитяло (Enzo Life Sciences, Farmingdale, САЩ).

Количественото определяне на сребърното оцветяване и имунооцветяването на Pizzolato беше направено с помощта на софтуера Image J. Всички оценки бяха извършени от наблюдател, заслепен от експерименталното състояние. Плазмените нива на BUN, креатинин и фосфор са измерени с помощта на автоанализатор Cobas Integra 800 (Roche, Mannheim, Германия).

Оценяването на интензитета на сигнала на оцветяването с PTX3 при животни C57BL/6N, BALB/c и CD-1 не беше осъществимо с помощта на ImageJ, тъй като в криосекциите се виждаха големи кристални отлагания на калциев оксалат, показващи същото ниво на контраст като имунооцветяването. Следователно, оцветяването с PTX3 беше полуколичествено оценено с помощта на система за оценяване, където беше отбелязан силен положителен сигнал със стойност 2, слаб сигнал със стойност 1 и отсъствие на сигнал със стойност 0. Тази оценка беше проведена независимо за кората, медулата и папилата на една бъбречна секция и общият резултат е резултат от сумата от всички стойности, вероятно бушуващи от 0 до 6.

Транскутанно измерване на скоростта на гломерулна филтрация (GFR) при съзнателни мишки

За измерване на GFR мишките бяха анестезирани с изофлуран и миниатюризирано устройство за изобразяване, изградено от два светодиода, фотодиод и батерия (MediBeacon, Манхайм, Германия), беше монтирано чрез двустранна лепяща лента върху врата на обръснатите животни (64 ). За времето на запис (

1,5 ч) всяко животно е било в съзнание и е държано в една клетка. Преди интравенозното инжектиране на 150 mg/kg FITC-синистрин (MediBeacon, Манхайм, Германия), фоновият сигнал на кожата се записва за 5 минути. След премахване на устройството за изображения данните са анализирани с помощта на софтуера MPD Lab (MediBeacon, Mannheim, Германия). GFR [μl/min] се изчислява от намаляването на интензивността на флуоресценцията във времето (т.е. плазмен полуживот на FITC-синистрин), като се използва модел с две отделения, телесното тегло на животните и емпиричен коефициент на преобразуване (64).

Рентгенов дифракционен анализ на вътребъбречните кристали

Анализът на изсушената чрез замразяване бъбречна тъкан на мишка чрез рентгенова дифракция на прах беше извършен с Empyrean настройка от PANalytical. Рентгенова тръба Cu (линеен източник 12 × 0,04 mm 2) осигурява CuKa излъчване с l = 0,1542 nm. Линията Kb беше премахната от Ni филтър. Източникът и детекторът се движат във вертикална посока около фиксирана хоризонтална проба. След преминаване на дивергенционен процеп от 1/8 ° и анти-разсейващ процеп от 1/4 °, лъчът достигна пробата в центъра на phi-chi-z етап. В използваната геометрия на Bragg-Bretano лъчът е префокусиран при вторичен разминаващ се процеп от 1/4 °. И накрая, сигналът беше записан от пикселен детектор (256 × 256 пиксела от 55 μm) като функция от ъгъла на разсейване 2θ. Впоследствие пиковите позиции бяха изчислени от q = 2π /д = (4π/λ) sinθ, при което q е разсейващият вектор. Детекторът е използван в сканираща геометрия, която позволява всички редове да се използват едновременно.

Поточна цитометрия

Цели бъбреци се нарязват и се смилат в продължение на 30 минути при 37 ° C, като се използва колагеназа и разтвор на DNase I (и двете Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Германия). По-нататък пробите се прецеждат през 70 μm мрежа и се промиват с PBS. Мъртвите клетки бяха изключени от анализ с помощта на Zombie NIR ™ Fixable Viability Kit в съответствие с инструкциите на производителя и както е описано по-горе (65). CD45 + положителни клетки бяха идентифицирани с използване на белязано с PE-Cy ™ 5 антитяло (клон 30-F11, BD Biosciences, Franklin Lakes, USA). Анализът беше проведен с помощта на FlowJo v10.0.

Изследвания на клетъчната култура

Първични тубуларни епителни клетки (pTECs) бяха изолирани от бъбреци на мишки на възраст 3 седмици и се поддържаха в DMEM/F12, съдържащ 10% фетален телешки серум, 1% пеницилин-стрептомицин, 125 ng/ml простагландин Е1 (Calbiochem, Дармщат, Германия ), 25 ng/ml EGF, 1,8 μg/ml l-тироксин, 3,38 ng/ml хидрокортизон и 2,5 mg/ml инсулин-трансферин-натриев селенит (IT-SS) (всички от Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Германия, освен ако споменати), както е описано по-рано (66, 67). Всички клетки се култивират в инкубатор при 37 ° C, 5% CO2 и се стимулират с кристали CaOx (размер 1-2 μm; Alfa Aesar, Karlsruhe, Германия).

Подготовка на РНК и количествена PCR в реално време

Общата РНК се изолира от pTECs, като се използва комплект за екстракция на РНК Qiagen (Дюселдорф, Германия), следвайки инструкциите на производителя. След количествено определяне на качеството на РНК се оценява с помощта на агарозни гелове. От изолирана РНК се получава cDNA, като се използва обратна транскриптаза (Superscript II; Invitrogen, Carlsbad, USA). Количествената PCR в реално време (qPCR) беше извършена с помощта на SYBRGreen PCR master mix и беше анализирана с Light Cycler 480 (Roche, Mannheim, Германия). Всички стойности на генната експресия бяха нормализирани, използвайки 18S rRNA като домакински ген. Всички праймери, използвани за амплификация, са от Metabion (Martinsried, Германия) и са изброени в Таблица 1.

маса 1. Последователности на праймера за qPCR.

Имуноблотинг

След определяне на концентрацията на протеин в проби от урина, 50 μg от протеиновия разтвор се смесва с 4 × буфер за зареждане с натриев додецил сулфат и се денатурира при 95 ° С в продължение на 5 минути за Western blot анализ. След това протеините се разделят чрез електрофореза на натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел и се прехвърлят в мембрана от поливинилиден дифлуорид. Неспецифичното свързване с мембраната беше блокирано за 1 h при стайна температура с 5% обезмаслено мляко в буфериран физиологичен разтвор. След това мембраните бяха инкубирани една нощ при 4 ° С с първично антитяло за PTX3 (клон 2С3, Hycult Biotechs, Plymouth Meeting, САЩ), последвано от инкубация с вторично заешко анти-мише IgG HRP-белязано антитяло. Имунооцветените ленти бяха открити с помощта на хемилуминесцентен комплект (ECL комплект, GE Healthcare, Кардиф, Великобритания). Равно натоварване на пикочните протеини се визуализира чрез оцветяване на Ponceau Red (1 h при RT). Интензивността на оцветяването и за двете оцветявания беше допълнително анализирана чрез денситометрия (Изображение J). Миши PTX3 от проби от урина, както и рекомбинантната PTX3 положителна контрола показват очакваната лента около 45 kDa.

В Chemico Генериране и характеризиране на кристали на калциев оксалат

Кристалите на калциев оксалат с дефиниран размер и форма са генерирани, както е описано другаде (68). Накратко, 10 mM разтвори на натриев оксалат и 1 mM калциев хлорид бяха приготвени, използвайки 10 mM TRIS-HCl буфер (рН 7.3). За генериране на CaOx кристал 1 обем разтвор на натриев оксалат се инкубира през нощта при 4 ° С с 0,5 обем или PBS, или rhPTX3 в различни концентрации. След това се добавя 1 обем разтвор на калциев хлорид и се поддържа при 4 ° С в продължение на 24 часа. Размерът на кристалите CaOx в различните препарати се определя с помощта на микроскопия с ярка светлина или поточна цитометрия.

Рекомбинантен човешки PTX3

Човешкият PTX3 се рекомбинантно експресира в PerC6 човешка клетъчна линия. Накратко, клетките Per.C6 (Crucell, Leiden, Холандия) бяха стабилно трансфектирани с плазмиден вектор (pcDNA2001Neo-hPTX3), носещ човешката PTX3 cDNA под контрола на CMV промотора. След трансфекцията се подбира силно продуциращ клон и се разширява за експресия на протеин. Рекомбинантният протеин се пречиства от кондиционирана среда, като се използва многоетапна хроматографска стратегия, както е описано по-рано (69). Хомогенността на протеина в крайния продукт беше оценена чрез аналитична хроматография за изключване на размера (SEC), SDS-PAGE и имуноблотинг (39). N-свързаното гликозилиране на пречистения протеин беше изследвано с помощта на PNGase F (Sigma Aldrich), както е описано по-рано (37).

Статистически анализ

Данните са представени като средни стойности със SEM или като статистика на полето. Преди всеки друг статистически анализ, данните бяха проверени за нормално разпределение (тест на Шапиро-Уилк), хомосцедастичност (тест на Левен) и извънредни стойности (тест на Груб). Нормално разпределените и хомосцедастични набори от данни бяха тествани за статистически значими разлики чрез ANOVA и след хок Корекцията на Bonferroni е използвана за множество сравнения. Хетероскедастичните данни бяха коригирани след Games-Howell's след хок тест. Неразпределените набори от данни са сравнени с помощта на тестовете на Kruskal-Wallis и Nemenyi. Стойност на стр 0,05 n.s., стр Ключови думи: бъбречен камък, колики, хипероксалурия, кристали, нефролитиаза, уролитиаза, PTX3

Цитиране: Marschner JA, Mulay SR, Steiger S, Anguiano L, Zhao Z, Boor P, Rahimi K, Inforzato A, Garlanda C, Mantovani A и Anders HJ (2018) Дългият пентраксин PTX3 е ендогенен инхибитор на свързаната с хипероксалурия нефрокалциноза и хронична бъбречна болест. Отпред. Имунол. 9: 2173. doi: 10.3389/fimmu.2018.02173

Получено: 30 април 2018 г .; Приет: 03 септември 2018 г .;
Публикувано: 25 септември 2018 г.

Удай Кишор, Университет Брунел, Лондон, Великобритания

Робърт Брайдууд Сим, Университет в Оксфорд, Великобритания
Любка Т. Руменина, INSERM U1138 Center de Recherche des Cordeliers, Франция

† Тези автори са допринесли еднакво за тази работа