Д-р Тошиюки Хата

Катедра по хепатобилиарно-панкреатична и трансплантационна хирургия, Медицински факултет на Университета в Киото, Киото, Япония

Д-р Фатима Рехман

Департамент по биология, Университет на Северна Флорида, Джаксънвил, Флорида

Д-р Томохиде Хори

Катедра по хепатобилиарно-панкреатична и трансплантационна хирургия, Медицински факултет на Университета в Киото, Киото, Япония

Д-р Джъстин Х. Нгуен

Отдел по трансплантационна хирургия, клиника Майо, Джаксънвил, Флорида

Т. Хата проектира изследването, извърши експериментите и написа чернова на ръкописа; F.R. подпомагат проучвания, извършват тестове за сукцинат дехидрогеназа и преглеждат ръкописа; Т. Хори предостави реактиви и прегледа ръкописа; J.H.N. замисли концепцията, прегледа дизайна и анализа на данните, преработи и завърши ръкописа. Всички автори прегледаха и одобриха окончателната версия на ръкописа.

Резюме

Заден план:

Острата чернодробна недостатъчност (ALF) от тежко остро чернодробно увреждане е критично състояние, свързано с висока смъртност. Целта на това проучване беше да се изследва въздействието на превантивното приложение на γ-аминомаслена киселина (GABA) върху чернодробното увреждане и резултатите от оцеляването при мишки с експериментално индуцирана ALF.

Материали и методи:

За предизвикване на ALF, на мишки C57BL/6NHsd се прилага GABA, физиологичен разтвор или нищо в продължение на 7 дни, последвано от интраперитонеално приложение на 500 μg туморен фактор некроза α и 20 mg D-галактозамин. Изследваните мишки бяха хуманно евтаназирани 4 до 5 часа след предизвикване на ALF или наблюдение за оцеляване. Протеините, присъстващи в кръвните проби и чернодробната тъкан от евтаназирани мишки, бяха анализирани с помощта на Western blot и имунохистохимични и хистопатологични анализи. За проучвания за инхибиране, ние прилагахме специфичния за STAT3 инхибитор, NSC74859, 90 минути преди индукция на ALF.

Резултати:

Установихме, че третирани с GABA мишки имат значително отслабване на TUNEL-положителни хепатоцити и хепатоцелуларна некроза, намалени нива на каспаза-3, H2AX и р38 MAPK протеин; и увеличени експресии на Jak2, STAT3, Bcl-2 и Mn-SOD, с подобрена митохондриална цялост. Намалените апоптотични протеини водят до значително удължено оцеляване след индукция на ALF при мишки, лекувани с GABA. Специфичният за STAT3 инхибитор NSC74859 елиминира предимството за оцеляване при третирани с GABA мишки с ALF, което показва участието на пътя STAT3 в индуцирано от GABA намаляване на апоптозата.

Заключения:

Нашите резултати показаха, че превантивното лечение с GABA е защитено срещу тежко остро чернодробно увреждане при мишки чрез GABA-медиирано STAT3 сигнализиране. Превантивното приложение на GABA може да бъде полезен подход за оптимизиране на маргинален донорен дроб преди трансплантацията.

Графичен резюме

GABA (ƴ-аминомаслена киселина) предпазва от увреждане на черния дроб чрез Stat-3 сигнал. При този модел на тежко чернодробно увреждане, индуцирано с фактор на туморна некроза (TNF) и D-галактозамин (Gal), предварителната обработка с GABA значително удължава индуцираните от TNF/Gal мишки със средна стойност от 12,15 часа в сравнение с предварително обработения с физиологичен разтвор TNF/Индуцирани от Gal животни, 6,23 часа. Когато специфичният инхибитор Stat-3 NSC74859 се прилага 90 минути в GABA-третирани TNF/Gal-индуцирани мишки, GABA-медиираното предимство за оцеляване се премахва.

киселина

Въведение

γ-аминобутировата киселина (GABA), добре познат инхибиторен невротрансмитер, наскоро е показал, че има регенеративно въздействие и е замесен в зрителната функция на кората при възрастни маймуни и в неврогенезата на възрастни (1–3). В периферните тъкани е доказано, че GABA намалява възпалението на бета-клетките (4), регенерира бета-клетките на панкреаса и обръща експерименталния захарен диабет (5-7); GABA може също да индуцира клетки, произвеждащи аглюкагон, в бета-клетки, произвеждащи инсулин, което може да доведе до потенциална терапия за захарен диабет тип 1 (8). Ролята на GABA в други периферни органи обаче е по-слабо разбрана. GABA е хидрофилен, когато се прилага, остава в периферните органи и не преминава кръвно-мозъчната бариера (9); по този начин е подходящ за използване в експерименти за регенерация, включващи черния дроб и други периферни органи. За разлика от тях, хидрофобният мусцимол, специфичен за GABA агонист, лесно прониква през кръвно-мозъчната бариера (10) и следователно не е подходящ за такива експерименти. По същия начин бикукулинът, специфичен за GABA антагонист, е лесно пропусклив през кръвно-мозъчната бариера; предизвиква припадък (11) и клетъчна пролиферация (10) и също не е подходящ за нашите цели.

GABA отдавна се разглежда като страничен продукт от чернодробно заболяване и допринася за чернодробната енцефалопатия при пациенти с цироза (12). Въпреки това, GABA също е все по-широко признато да въздейства върху периферните органи. GABA се свързва с хепатоцитния GABA-A рецептор бета3 (Gabrb3) (13), хиперполяризира хепатоцитите и черния дроб (14), индуцира активиране на клетъчния цикъл, арестува хепатоцитите във фазата на пролука 2 (G2) на клетъчния цикъл и намалява хромозомните аномалии ( 13) и намалява злокачествения потенциал (13, 14). GABA обаче не трябва да се прилага след частична хепатектомия, тъй като, поради присъщото си свойство, той спира регенерацията на черния дроб (15, 16). В комбинация с хитозан в наночастици е показано, че GABA стимулира синтеза на ДНК за регенериране на черния дроб при плъхове (17, 18) и предизвиква пролиферация и диференциация на холангиоцитите в образуването на малки жлъчни пътища (19). Неотдавнашната работа показа защитната роля на GABA сигнализирането срещу остро увреждане на черния дроб (20, 21). В предишни проучвания наблюдавахме благоприятен ефект на GABA в миши модел на почти тотална хепатектомия и модел на частична чернодробна трансплантация на плъхове (22, 23). Ефектът на GABA върху нехирургично тежко чернодробно увреждане обаче не е известен.

В това проучване имахме за цел да оценим въздействието на превантивното приложение на GABA върху тежкото остро чернодробно увреждане. Използвахме миши модел на летална остра чернодробна недостатъчност, която беше индуцирана с фактор на туморна некроза α (TNF-α) и D (+) - галактозамин (D-gal), за да се изследва потенциалното въздействие на GABA върху тежко чернодробно увреждане. Предполага се, че превантивното приложение на GABA преди остро чернодробно увреждане има защитен ефект.

Материали и методи

Животни

Инбредни мъжки мишки C57BL/6NHsd (възраст, 7–11 седмици; тегло, 21–28 g) (Harlan Laboratories, Indianapolis, Indiana) бяха настанени при специфични, без патогени условия с 12-часови светлинни/тъмни цикли, храна и вода. Всички експериментални протоколи са одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните в клиника Мейо (протокол №> A40711) и са извършени съгласно институционалните насоки.

Антитела и реактиви

Протокол за администриране на GABA

Мишките бяха подложени на ежедневно интраперитонеално приложение на GABA (500 μmol [50 mg]) в 0,5 ml физиологичен разтвор или 0,5 ml физиологичен разтвор само в продължение на 7 дни. Нормалните контролни мишки не получават физиологичен разтвор или GABA (Фигура 1А). Теглото на тялото на мишките е получено преди първото (ден -7) и последното (-5 минути) администриране.

Дизайн на изследването и базови характеристики. A, Цялостен дизайн на изследването, включващ предварителна обработка с GABA, физиологичен разтвор или нищо, и индукция на остра чернодробна недостатъчност (ALF) с TNF-α и D-gal. B-E, изходни характеристики на изследваните животни без индуцирана ALF. B, тегло (n = 10/изследвана група), измерено 7 дни преди и непосредствено преди индукция на ALF. Мишките са имали значителни и подобни тенденции в наддаването на тегло (P Фигура 1А). На 4 до 5 часа след индукция на ALF животните бяха хуманно евтаназирани с предозиране с пентобарбитал. Кръв е взета чрез сърдечна пункция; черният дроб след това се перфузира с 3 ml физиологичен разтвор през порталната вена при 1,5 ml/min и впоследствие се набавя. Лявият страничен лоб беше фиксиран в 10% буфериран формалин; други лобове бяха незабавно замразени в течен азот. За проучванията за оцеляване бяха оценени условията на мишките, с неврологични находки въз основа на скала на мишка кома, за която сме докладвали по-рано (етап 0, нормален; етап 1, възбуден; етап 2, атаксичен; етап 3, сънлив с непокътнати рефлекси; етап 4, запушен и коматозен) (25, 26).

Инхибиране на STAT3 Pathway

Пътят на STAT3 беше тестван с помощта на селективен инхибитор, NSC74859 (27). Накратко, 5 mg/kg NSC74859 в 5% DMSO или 5% DMSO самостоятелно (носител) се дава интраперитонеално 90 минути преди TNF-α и D-gal.

Чернодробни биохимични анализи

Кръвните проби се центрофугират при 1000 х g за 10 минути, за да се получат серумни проби. Набор за реактив на аланин аминотрансфераза (ALT) (37490, Biotron Diagnostics, Hemet, Калифорния), комплект реагент за общ билирубин (0070, Biotron Diagnostics) и комплект за анализ на урея QuantiChrom (DIUR-500, BioAssay Systems, Hayward, California) анализирайте серумните концентрации според инструкциите на производителя. Пробите бяха оценени с помощта на четец за микроплаки (SpectraMax M5, Molecular Devices, Сънивейл, Калифорния).

Спектрофотометричен куплиран тест за сукцинат дехидрогеназа

Сукцинатна дехидрогеназа (SDH) се определя с помощта на комплект за колометричен анализ на BioVision глутамат дехидрогеназа (Cat. K729-100), съгласно инструкциите на производителя. Взети са серумни проби, както е описано по-горе; Бяха изследвани 100 μg серумни протеини от всяко животно.

Анализи на Western Blot

Хистологични анализи

Чернодробни проби, фиксирани в 10% буфериран формалин, бяха вградени в парафин и 5-μm дебели участъци бяха оцветени с хематоксилин-еозин, TUNEL (терминална дезоксинуклеотидил трансфераза dUTP маркиране на краищата) и фосфо-STAT3. TUNEL оцветяването се извършва по инструкции на производителя, като се използва комплект за откриване на апоптоза ApopTag In Situ (S7100, Millipore) и DAB (3,3’-диаминобензидин) Quanto (TA-060-QHDX, Millipore). Бяха получени десет произволни изгледа на всяка проба в поле с висока мощност и TUNEL-положителните клетки бяха преброени отделно с помощта на микроскоп (BX50; Olympus, Center Valley, Пенсилвания) и софтуер за изображения (DP Controller, Olympus). Имунохистохимичното оцветяване с антитела срещу фосфо-STAT3 (клетъчно сигнализиране, 9145) се извършва с помощта на Vectastain Universal Elite ABC Kit (PK-6200; Vector Laboratories, Burlingame, California), Avidin/Biotin Blocking Kit (SP-2001, Vector Laboratories), и DAB Quanto, съгласно инструкциите на производителя.

Статистически анализи

Направихме следните статистически анализи за оцеляване, използвайки SigmaPlot 11.0 (Systat Software, Сан Хосе, Калифорния): несдвоен t тест, U-тест на Mann-Whitney, анализ на дисперсията и log-rank тест. Данните са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM), със стойности на P Фигура 1А) и не показват неблагоприятни ефекти от GABA върху движението, диетата и социалното поведение. Освен това не са забелязани значителни разлики в средното телесно тегло преди или след приложението на GABA, въпреки че телесното тегло се е увеличило значително във всяка група през целия интервал на изследване (Фигура 1В; P = .001). Анализите на серума не показват значителни разлики в нивото на ALT (Фигура 1C) и общото ниво на билирубин (Фигура 1D) между 3-те проучвани групи, което показва липса на неблагоприятен ефект на GABA върху чернодробната функция. Въпреки това, групата, лекувана с GABA, има значително по-високи серумни нива на урея, отколкото групата, получаваща физиологичен разтвор (P Фигура 1Е). Черният дроб изглежда нормално макроскопски за всички групи и не показва очевидни разлики в цвета и размера. Освен това не са наблюдавани очевидни разлики в оцветяването с хематоксилин-еозин (Фигура 1F).

GABA защитава срещу тежки чернодробни наранявания

След това се опитахме да проучим ефекта от предварителната обработка на GABA върху реакцията на мишката при остро чернодробно увреждане. Експериментален модел на остра чернодробна недостатъчност, индуцирана с D-gal и TNF-α, е добре установен в нашата лаборатория (25). Експерименталните животни са получили TNF-α, 1.0 μg/мишка и D-gal, 20 mg/мишка - комбинация, която винаги е фатална в рамките на 18 часа след индуцирана ALF. Черният дроб на мишките в контролната и физиологичната група изглеждаше тъмен и претоварен, което предполага сериозно увреждане на черния дроб, докато тези от групата GABA изглеждаха почти нормални (Фигура 2А). Оцветяването с хематоксилин-еозин показва дифузен кръвоизлив и некроза в черния дроб на контролните и физиологични мишки, докато чернодробните структури се поддържат добре в черния дроб на мишки, третирани с GABA. TUNEL-положителни клетки бяха наблюдавани в черния дроб на контролните и физиологичните разтвори (Фигура 2А). Броят на TUNEL-позитивните клетки на поле е значително намален в черния дроб на мишки, третирани с GABA, което показва значително отслабване на апоптотичното увреждане (Фигури 2А и 2В). Серумните нива на ALT също бяха значително намалени в групата на GABA (Фигура 2С). Освен това, Western blot анализи на чернодробни екстракти показват по-ниска експресия както на разцепена каспаза-3, така и на фосфо-хистон H2AX в групата на GABA, което показва затихване на апоптотичната клетъчна смърт (Фигури 2D, 2E и 2F).