Резюме

Заден план

Докато най-често срещаните фармакологични лечения за автоимунни бъбречни патологии са добре проучени, билковите лекарства често се пренебрегват. В това проучване е изследван ефектът от лечението с билки Canephron® N (CAN) в модел на плъх на активен автоимунен гломерулонефрит на Heymann (AIG).

ефективност

Методи

Четиридесет мъжки конвенционални плъхове BDIX и шест женски плъхове бяха разделени на следните групи: здрави животни, AIG, AIG, третирани с CAN, AIG, третирани с преднизолон, AIG, третирани с преднизолон и CAN.

Резултати

Преднизолон или CAN монотерапия включва различни положителни фармакологични ефекти.

Плъховете, получаващи преднизолон, показват умерено увеличение на броя на CD4 + лимфоцитите, увеличаване на CD8 + броя на цитотоксичните лимфоцити, но непълно нормализиране на CD4 +/CD8 + лимфоцитното съотношение. Намалява общия брой на лимфоцитите. Концентрацията на имунните комплекси и нивото на криоглобулин намалява значително. Монотерапията с преднизолон осигурява умерено намаляване на параметрите на нефротичния синдром.

Монотерапията с CAN не повлиява имунологичните параметри и съотношението на субпопулация CD4 +/CD8 +, но намалява значително нивото на имунните комплекси в сравнение с AIG. Основните нефропротективни ефекти на лекарството са нормализиране на диурезата и скоростта на гломерулна филтрация. Наблюдавано е значително намаляване на левкоцитурията в сравнение с групата на AIG.

Най-положителните ефекти са наблюдавани в комбинираната група Преднизолон + CAN. Заедно с положителните имунологични промени в свързаните с клетките и хуморалните връзки на имунитета (ефекти на преднизолон), бъбречната функция се подобрява значително: намалява протеинурията, намаляват креатининът и уреята в кръвта, намаляват нивата на AOPP и PCO (комбинирани ефекти на CAN). Качествените разлики предполагат синергични ефекти на комплексната терапия с глюкокортикоиден имуносупресор и растителното лекарствено лекарство.

Заключения

Моделът AIG, използван в това проучване, съответства на човешки мембранозен гломерулонефрит по отношение на клиничната морфология. Монотерапията с преднизолон показва адекватна ефикасност по отношение на имунните и метаболитните компоненти на бъбречното заболяване.

Доказано е, че монотерапията с билки частично нормализира уродинамиката.

Комбинирането на CAN с имуносупресора преднизолон насърчава по-положителни фармакодинамични ефекти върху имунната и бъбречната система на плъхове.

Комбинираното лечение може да бъде полезно в клиничната нефрологична практика, включително пациенти с бъбречни автоимунни заболявания и трябва да бъде изследвано допълнително.

Заден план

Предклиничните и клиничните нефрологични проучвания се фокусират върху три теми: 1) подобряване на диагностиката на бъбречната недостатъчност [1, 2], 2) разработване на ефективни диализни устройства и режими на детоксикация [3], 3) търсене на нови медицински продукти за профилактика и консервативно лечение на бъбречни патологии на различни генети [4].

Автоимунната бъбречна патология, както при животински модели, така и при хора, се свързва с индуцирано от автоантитела разрушаване на нефронните структури, отлагане на имунни комплекси и миграция на левкоцити към бъбречните тъкани [5, 6]. Понастоящем най-често срещаното фармакологично лечение за ограничаване на производството на автоантитела от Т-хелпер-зависими автореактивни клонинги на В-лимфоцити са имунодепресанти като глюкокортикостероиди (преднизолон, метилпреднизолон), цитостатични лекарства (циклофосфамид, хлорамбуцил), лимфофосфат инхибират монохидрогеназата микофенолат мофетил), инхибитори на калциево зависими Т-клетъчни пътища на трансдукция на сигнала (циклоспорин А, такролимус), супресори на транскрипция на дискретна група лимфокинови гени, моноклонални антитела и др. Основната терапия на автоимунната бъбречна патология включва имунодепресантите преднизолон, метилпреднизолон азатиоприн, циклофосфамид, микофенолат мофетил, циклоспорин А и такролимус [7]. Лечението включва също антикоагуланти от хепариновата група, ангиопротектори [8] и растителни лекарствени продукти [9].

Билковите лекарствени продукти при лечението на тази патология често се считат за последни. През годините е натрупан значителен опит с фитотерапията при бъбречни и пикочни заболявания [4, 9, 10]. Въпреки това доказателствената основа, както предклинична, така и клинична, за лечение на бъбречни заболявания с фитотерапия остава все още недостатъчна.

Растителният лекарствен продукт Canephron N (CAN), произведен от Bionorica SE, съчетава три билкови компонента: розмарин, любимец и столетник [11]. Фармакологичните ефекти на CAN се състоят от противовъзпалителни, диуретични и нефропротективни ефекти [12]. Основните предимства на това лекарство са наличието на фармацевтичния пазар, висока ефикасност при различни бъбречни и пикочни патологии, безопасността и възможността да се използва при деца и по време на бременност. Безопасността и ефикасността на CAN е показана при бременни жени с късна гестационна токсикоза [13, 14]. Основните проучвания, както клинични [15, 16], така и предклинични [17], доказват ефикасността на лекарството при тубулна патология, като пиелонефрит и тубулоинтерстициален нефрит, като част от комбинираната терапия с антибактериални лекарства (пефлоксацин, амоксиклав, рокситромицин) [18 ].

Целта на това проучване е да изследва нефропротективните ефекти на CAN в сложна фармакотерапия в модел на плъх на активен автоимунен гломерулонефрит на Heymann (AIG). Изследването обхваща следните групи: 1) здрави животни, 2) животни с AIG, 3) животни с AIG, лекувани с CAN (в продължение на 60 дни), 4) животни с AIG, третирани със стандартния имунодепресант преднизолон (в продължение на 60 дни) и 5) животни с AIG, лекувани с преднизолон в комбинация с CAN (за 60 дни). Оценката на фармакологичния ефект на леченията беше извършена с помощта на серия от лабораторни тестове, препоръчани за предклинични проучвания [19].

Методи

Животни

Работата с лабораторните животни беше в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни (САЩ, Национална академия, Вашингтон, окръг Колумбия, 1996); Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни (FELASA, 2010); Лабораторни животни (насоки, Руска академия за медицински науки, Москва, 2003) [20]. Проведени са експерименти с 40 мъжки конвенционални плъхове BDIX и 6 женски плъхове [21] с тегло 200–220 g, закупени от Института по физиология на Павлов, Руска академия на науките (Санкт Петербург, Русия). Експерименталният протокол, следван в това проучване, беше изцяло одобрен от Комитета по биоетика за грижа за животните към Института по токсикология.

Моделиране на автоимунен гломерулонефрит (AIG)

За да се предизвика активен гломерулонефрит на Heymann, бъбреците на майката бяха изолирани и хомогенизирани, освободени от съединителна тъкан и смесени с пълен адювант на Freund (1: 1) [22–24]. По този начин е получен майчиният бъбречен антиген, съдържащ гликопротеин gp330. На възраст от 3 месеца плъховете от поколение f 1 се имунизират чрез две интраперитонеални приложения на майчиния бъбречен антиген (10 mg/200 g телесно тегло) с 14-дневен интервал. 28 дни след втората имунизация се оценява тежестта на протеинурията (протеинурията при експериментални плъхове е била най-малко 0,5 g/mmol креатинин/ден) и плъховете са разделени на следните групи: здрави животни, които не получават имунизация (Здрави н = 8), контрол на патологията (AIG, н = 8), преднизолонова терапия (преднизолон, н = 8), CAN лечение (CAN, н = 8), лечение с преднизолон + CAN (Преднизолон + CAN, н = 8). Преднизолон е прилаган при 10 mg/kg/ден, CAN перорални капки при 3.0 ml/kg/ден [25]. Прилагането на лекарството се извършва чрез нетравматичен сондаж (p.o.) веднъж дневно в продължение на 60 дни. 60 дни след края на лечението, 24-часова урина се събира от плъхове и впоследствие животните се евтаназират под упойка (золазепам + тилетамин 1: 1, 20 mg/kg) чрез моментално обезглавяване с вземане на кръвни проби за биохимични и имунологични тестове.

Параметри и тестове

Двадесет и четири часа обем на урината се определя в края на експеримента (ден 60) чрез поставяне на всички плъхове за 24 часа в метаболитни клетки (Tekniplast Gazzada, Италия) със свободен достъп до вода (100 ml на всеки плъх) без храна. Основните маркери на бъбречната патология (нефротичен синдром) са нивата на протеини и еритроцити в урината. Урината се анализира с помощта на тест ленти Auction Sticks 10EA на AutionEleven АЕ-4020 (Arkray Factory, Inc. (Япония)). Взетите проби от урина бяха анализирани за брой на еритроцитите, левкоцитите, отливките (суправитално оцветяване по метода на Щернхаймер-Малбин с микроскопия в увеличение × 100 и × 400) [26, 27], ниво на протеин (при използване на метод на свързване на пирогалол червено при 600 nm) и ниво на креатинин (използвайки псевдокинетична реакция на Jaffe при 505 nm) [28]. Протеинурията в 24-часовата урина се изчислява като g протеин на mmol креатинин. Използвани са готови за употреба комплекти за клинична химия, произведени от Abris + и Olvex Diagnosticum (Русия). Скоростта на гломерулна филтрация (GFR ml/min) се изчислява, като се използва уравнението, описано от Методи в бъбречната токсикология [29].

Кръвта се взема в епруветки с антикоагулант литиев хепарин за имунологични тестове и в епруветки за активиране на съсиреци за биохимични тестове (Vacuette).

Имунофенотипиране на лимфоцити

За да се оцени броят на CD4 + и CD8 + Т-лимфоцитите, бяха използвани миши моноклонални антитела: PE белязан анти-плъх CD45, FITC белязан анти плъх CD3, APC белязан анти плъх CD4a, PerCP белязан анти плъх CD8a (BD Pharmingen). 10 μl смес от антитела се добавят към 50 μl кръв и се инкубират в продължение на 30 минути при стайна температура. След това се добавят 450 μl 1% BD FACSC ™ разтвор за лизиране (BD, САЩ) и се инкубират в продължение на 30 минути. Цитометрията се извършва на поточен цитофлуориметър BD FACSCalibur ™ (BD Biosciences, САЩ), като се използва универсален софтуер CellQuestPrO [30]. Във всяка проба бяха измерени най-малко 10 хиляди клетки.

Нивото на имунните комплекси (CIC) се определя с помощта на турбидиметрия в присъствието на 3,5% PEG-6000 в боратен буфер при 450 nm [28, 31]. Нивото на криоглобулина се определя след 7-дневна серумна инкубация при +4 ° C в присъствието на натриев азид, криопреципитатно центрофугиране, утайка, разтворена в 0,1 М натриев хидроксид и спектрофотометрия при 260 и 280 nm [31].

Серумното ниво на биомаркерите за бъбречно увреждане, т.е. урея (азот в уреята в кръвта, BUN) и креатинин, се определя с помощта на UV-кинетичен метод и холестерол при 500 nm с помощта на комплекти Randox Laboratories Ltd. (UK) [28]. Нивото на напреднали окислителни протеинови продукти (AOPP) като маркер на хронично бъбречно заболяване се оценява при 340 nm, използвайки метода на Witko-Sarsat [32], карбонилен протеин (PCO) се свързва с 2,4-динитрофенилхидразин при 370 nm [33] . Измерванията бяха извършени с помощта на четец на микроплаки Synergy2 (BioTek Instruments, Inc., САЩ). Коректността на измерванията беше осигурена с помощта на контролен серум (ниво на калибриране 1-3) от Randox Laboratories Ltd. (Великобритания) и материали за урина (Liquichek урина анализ ниво 1-2) от Bio-Rad (САЩ).

Статистическите тестове бяха извършени с помощта на софтуера Statistica 8.0 за Windows. Непараметричният тест на Kruskall-Wallis и Mann-Whitney U са използвани тестове. Данните са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Значимостта на разликите е оценена при стр ≤ 0,05 [34].

Резултати и дискусия

Животните с AIG показаха имунопатологични промени, характерни за автоимунната патология: статистически значимо намаляване на кръвните CD8 + Т-клетки, на CD4 + Т-помощни клетки и повишаване на имуно-регулаторния индекс (стр ≤ 0,05). CD4 + Т клетките играят критична роля в индукцията на нефрит на Heymann. Концентрацията на серумните циркулиращи имунни комплекси (CIC) се е увеличила значително (приблизително 25 пъти), а нивото на криоглобулина се е увеличило 5,4 пъти в сравнение със здрави плъхове (Фигури 1 и 2).