1 Катедра по физиологични науки, Калифорнийски университет, Лос Анджелис, Лос Анджелис, Калифорния 90095-1527

върху

1 Катедра по физиологични науки, Калифорнийски университет, Лос Анджелис, Лос Анджелис, Калифорния 90095-1527

Резюме

Това проучване е предназначено да изследва връзката между индуцирана от диетата инсулинова резистентност/хиперинсулинемия, хипертрофия на мастните клетки и хормон-чувствителна липаза (HSL), за да се изясни дали атенюираната активност на HSL води до затлъстяване. Женските плъхове Fischer 344 са хранени или с нискомаслена, сложна въглехидратна диета, или с високомаслена, рафинирана захар (HFS) диета за 2 седмици, 2 месеца или 6 месеца. По това време се определят морфологията на мастната тъкан и активността на HSL, както и нивата на свободни мастни киселини и глицерол в плазмата. Не са наблюдавани разлики между групите след 2 седмици с изключение на съобщената по-рано хиперинсулинемия при HFS животни. Както на 2, така и на 6 месеца, животните с HFS демонстрират хипертрофия на адипоцитите. Базалните и стимулирани HSL активности и плазменият глицерол са значително повишени в групата на HFS. Налице е положителна корелация между размера на адипоцитите и активността на HSL както за базалното, така и за стимулираното състояние. Тези резултати показват, че атенюирана активност на HSL не се наблюдава с появата на инсулинова резистентност/хиперинсулинемия и следователно не играе роля в развитието на затлъстяване.

не е тайна, че най-старото и често срещано метаболитно нарушение, засягащо хората, е затлъстяването (58). Изчислено е, че икономическата тежест на заболяването, свързано с него, е по-голяма от 39 милиарда долара годишно (18). Тази цифра несъмнено се увеличава, тъй като разпространението на затлъстяването както при деца, така и при възрастни се увеличава (27, 34, 52). Затлъстяването, особено коремното затлъстяване, е част от група от атеросклеротични рискови фактори, включващи синдрома на инсулинова резистентност (46). Много изследователи (9, 20, 46) вярват, че инсулиновата резистентност е основният дефект, който в крайна сметка води до хиперинсулинемия, хипертриглицеридемия, хипертония и затлъстяване. Повишената активност на симпатиковата нервна система е замесена като друга последица от инсулиновата резистентност/хиперинсулинемия (36, 50).

Типичната западна диета е с много високо съдържание на мазнини и захароза и се счита за основен фактор, участващ в развитието на инсулинова резистентност и затлъстяване. Наскоро демонстрирахме на животински модел, че инсулиновата резистентност предхожда развитието на затлъстяване, когато животните се хранят с диета с високо съдържание на мазнини, захароза (HFS) (9). Инсулиновата резистентност настъпва само за 2 седмици. Много други изследователи са демонстрирали подобен времеви ход за развитието на инсулинова резистентност/хиперинсулинемия при животни, хранени или с диета с високо съдържание на мазнини, или с диета с високо съдържание на захароза (17, 29, 57). Oscai et al. (41, 42) са показали в дългосрочни експерименти, че животните, хранени ad libitum, са яли изокалорични количества от диета с HFS или диета с ниско съдържание на мазнини и нишесте и въпреки това са затлъстявали по време на диетата HFS. Storlein et al. (57) демонстрира, че след ∼4 седмици с контролиран прием на калории групата с високо съдържание на мазнини показва значително увеличение на теглото на бялата мастна тъкан без промяна в телесното тегло в сравнение с групата с високо съдържание на въглехидрати.

Следователно настоящото проучване е предназначено за количествено определяне на активността на HSL в зависимост от времето, когато животните са отглеждани на HFS спрямо диета с ниско съдържание на мазнини, сложни въглехидрати (LFCC). Изследвания на базална и стимулирана HSL активност бяха проведени, започвайки от 2 седмици върху диетите, за да се види дали HSL активността е потисната преди хипертрофия на мастните клетки.

Животни и диети.

Инбредни женски плъхове Fischer 344 са получени от Harlan Sprague Dawley (Сан Диего, Калифорния) на възраст 2 месеца. Използвани са женски плъхове, тъй като по-рано съобщаваме, че те развиват инсулинова резистентност, хиперинсулинемия и затлъстяване в отговор на диета с високо съдържание на мазнини, рафинирана захар (7-9, 29). Плъховете бяха оставени да се аклиматизират в новата си среда за 1 седмица, преди да бъдат назначени или на LFCC диета, или на HFS диета. И двете диети съдържат стандартна витаминно-минерална смес, както е описано по-горе (8, 9). Накратко, процентното разпределение на калориите и калоричната плътност на диетите LFCC и HFS са както следва: 23% протеин, 9% мазнини, 68% нишесте, 0,0% захароза и 13,8 kJ/g за LFCC срещу 21% протеин, 39% мазнини, 0,0% нишесте, 40% захароза и 19,7 kJ/g за HFS. Храната се приготвя под формата на прах от Purina Mills и се доставя ad libitum заедно с вода на животните, които се настаняват по четири на клетка с 12: 12-часов цикъл светлина-тъмнина при 24-25 ° C. Комитетът за изследвания на животните в Калифорнийския университет в Лос Анджелис одобри този протокол.

Хистология на мастната тъкан.

Част от подложката на мастната тъкан се изплаква с 0,85% разтвор на NaCl и след това се поставя в разтвор на 10% фосфатно буфериран формалин. След това тези проби от мастна тъкан бяха подготвени за секциониране и оцветяване с хематоксилин и еозин чрез прехвърляне на мастната тъкан в касети за дехидратация, инфилтрация и вграждане в парафин (53). Секциите бяха нарязани с дебелина 4 μm на три различни дълбочини (най-малко 200 μm един от друг) в рамките на една и съща тъканна проба и фиксирани към предметни стъкла. След това пробите бяха наблюдавани под микроскоп и бяха взети видео отпечатъци за определяне на размера и броя на клетките. Директните микроскопични наблюдения са направени във видео отпечатъци с помощта на видеопринтер CODONICS VP-3500, прикрепен към система за анализ на изображения на Perceptive Systems, която използва микроскоп Olympus BH2 като свой основен апарат. От видео изображенията, направени на слайдовете, броят на клетките в известна област е използван за изчисляване на средния обем на клетките и средния брой клетки на грам тъкан. Lemonnier (37) и Ashwell et al. (5) и двете описват подробно тази техника и са установили, че постоянен корекционен коефициент от 1,15 може да се използва за регулиране на видимия диаметър на клетките на неподвижни клетки.

Химия на кръвта.

След едно нощно гладуване животните се анестезират с хлоралхидрат (7%, 0,5 ml/100 g телесно тегло) и се взема кръвна проба чрез сърдечна пункция в спринцовка, съдържаща EDTA като антикоагулант. След това пробата се центрофугира в продължение на 20 минути, плазмата се отделя и пробата се замразява и съхранява при -70 ° С до по-нататъшен анализ. Концентрациите на свободни от плазма мастни киселини (FFA) се определят ензимно (Wako Chemicals) от пробите при 2 седмици, 2 месеца и 6 месеца и в двете групи. С помощта на диагностичен комплект Sigma, плазмените концентрации на глицерол се определят с помощта на ензимен метод, както е описано по-горе (8) по едно и също време.

Адипоцитна HSL активност и анализ на глицерол.

Ефектът от активността на симпатиковата нервна система както върху базалната, така и върху максималната HSL реакция се измерва с помощта на β-блокер. Пропранолол (1 mg/kg) се прилага интерперитонеално в подгрупа от HFS животни на 2 месеца, 20 минути преди да бъдат убити, за да блокира активирането на симпатиковата нервна система на HSL. Анализът за HSL активност от тази група се извършва, както е описано по-горе.

Статистически анализ.

Данните от експериментите бяха анализирани с помощта на Student’sт-тест или ANOVA, последвано от повторни мерки т-тест. Отчетените стойности са изразени като средни стойности ± SE. Статистическата значимост беше приета на P

Таблица 1. Ефект на диетата върху размера и броя на адипоцитите

Стойностите са средни стойности ± SE за 8 плъха във всяка група. LFCC, въглехидрат с ниско съдържание на мазнини; HFS, високомаслена, рафинирана захар.

Таблица 2. Ефект на диетата върху нивата на глицерол и FFA на гладно

Стойностите са средни стойности ± SE. Глицерол: 2 седмици, н = 7 плъхове/група; 2 месеца, н = 8 плъха/група, 6 месеца, н = 10 плъха/група. Свободна мастна киселина (FFA): 2 седмици, н = 6 плъхове/група; 2 месеца, н = 6 плъхове/група; 6 месеца, н = 8 плъха/група.

* P † P

Фиг. 1.Ефект на диетата върху активността на хормоночувствителната липаза (HSL). Стойностите са средни стойности ± SE; н, не. на плъхове. HFS, високомаслена, рафинирана захар; LFCC, нискомаслени, сложни въглехидрати. Базалната и стимулирана HSL активност не се различава значително сред 3-те точки от времето за плъхове LFCC. На 2 седмици няма значителна разлика между LFCC и HFS групи нито за базална, нито за стимулирана HSL активност. На 2 и 6 месеца както базовите, така и стимулираните HSL активности бяха значително увеличени при HFS в сравнение с LFCC плъховете.


Фиг. 2.Връзка между размера на мастните клетки и активността на HSL. Стойностите са средни стойности ± SE. И с двете групи LFCC и HFS, има много значима корелация между размера на мастните клетки и активността на HSL както за базалното, така и за стимулираното състояние.

Изследване на пропранолол.

Пропранолол се използва, за да се определи дали повишената базална скорост на липолиза при HFS плъховете е резултат от повишена активност на симпатиковата нервна система. При HFS плъхове на 2 месеца, при които активността на HSL се увеличава, инжектирането на пропранолол няма ефект върху повишената базална активност на HSL (2,0 ± 0,2 срещу 1,9 ± 0,2 μmol глицерол ⋅ 10 6 клетки −1 ⋅ h −1 за контрол срещу пропранолол, съответно). Ефективността на пропранолола беше демонстрирана, тъй като той напълно блокира стимулираното от изопротеренол освобождаване на глицерол (2,2 ± 0,2 срещу 3,4 ± 0,3 μmol глицерол ⋅ 10 6 клетки −1 ⋅ h −1 за пропранолол спрямо контрола, съответно).

В съгласие с повишаването на плазмените нива на глицерол са данните, които показват повишена базална и стимулирана скорост на липолиза in vitro в мастната тъкан от двете HFS животни на 2 и 6 месеца в сравнение с LFCC животните. Увеличенията както на базалните, така и на стимулираните нива на активност на HSL бяха силно свързани с увеличенията на обема на адипоцитните клетки, открити през тези периоди от време, което е в съгласие с по-ранни проучвания както при плъхове (13, 19, 55), така и при хора (4, 12, 15, 39,48). Доказано е също така, че по-големите мастни клетки включват повече глюкозен етикет в триглицеридите, като по този начин се демонстрира, че реестерификацията на мастните киселини е значително по-висока при по-големите мастни клетки (12,13, 54). Това може да обясни защо хипертрофия на мастните клетки се е появила при HFS плъхове въпреки увеличаването на активността на HSL.

Ранното развитие на хиперинсулинемия, което настъпва като последица от диетата с HFS, би могло да инхибира скоростта на липолиза in vivo. Нашите експерименти не подкрепят тази хипотеза, тъй като при 2 седмици плазмените нива на глицерол и FFA не са значително намалени в HFS в сравнение с LFCC животните. Тези открития in vivo са в съгласие с нашите in vitro експерименти с депо за мазнини, които не показват намаляване на базалната или стимулирана активност на HSL при 2 седмици. Що се отнася до другите изследвани моменти от време, повишените нива на липолиза in vitro съответстват на повишените плазмени нива на глицерол, наблюдавани на 2 и 6 месеца при HFS плъхове.

В обобщение, резултатите от това проучване показват, че диетата с HFS, в сравнение с нискомаслената, нишестена диета води до увеличаване на активността на HSL и хипертрофия на мастните клетки само за 2 месеца. На 2 седмици не се наблюдава разлика между двете групи за активност на HSL и серумен глицерол и FFA въпреки хиперинсулинемията. Тези резултати показват, че докладваното по-рано потискане на активността на HSL с остро излагане на инсулин не води до хронично потискане на HSL и развитие на затлъстяване. Увеличението на базалната и хормонално стимулирана активност не се дължи на повишаване на активността на симпатиковата нервна система, а е силно корелирано с размера на мастните клетки.

Това проучване беше подкрепено от Национален институт за остаряване Grant AG-07592 и от безвъзмездна помощ от Фондация за изследвания/образование L-B.