Юе-юе Джан, Хуан Хуанг, Ман Янг, Ли-джи Гу, Джиа-яо Джи, Ли-юн Уанг, Уей-джи Юан; Ефект на диета с ниско съдържание на протеини, допълнена с кетокиселини върху автофагия и възпаление при 5/6 нефректомирани плъхове. Biosci Rep 1 октомври 2015 г .; 35 (5): e00263. doi: https://doi.org/10.1042/BSR20150069

диета

Изтеглете файла с цитат:

ВЪВЕДЕНИЕ

Броят на пациентите с хронични бъбречни заболявания (ХБН) непрекъснато се увеличава по целия свят. Тъй като дългосрочната преживяемост на пациентите с ХБН е значително подобрена благодарение на развитието на диализни техники, недохранването е по-разпространено и сериозно от всякога. Недохранването и възпалителното състояние се насърчават положително взаимно в кръг, който ускорява артериалните лезии и накрая води до синдром на недохранване-възпаление-атеросклероза; нарастваща смъртност. Предлага се загуба на протеинова енергия (PEW), за да се обозначат едновременните загуби в запасите от протеини и енергия [1], а загубата на скелетни мускули е основната характеристика на PEW. Идентифицирането на механизма на PEW и проучването на интервенции за него ще помогне да се осигурят практически и ефективни лечебни подходи за подобряване на клиничната прогноза на пациенти с ХБН.

Митофагията, вид специфична митохондрия-деградираща автофагия, е способна да изчисти анормалните митохондрии и да контролира митохондриалната маса. В предишни проучвания този изследователски екип открива, че ХБН може да доведе до активиране на митофагия и повишени нива на митохондиралната ДНК (mtDNA) в скелетните мускули [13]; последователно открихме този път, че активираната митофагия не е в състояние да изчисти анормални митохондрии, които влошават загубата на скелетни мускули чрез активиране на възпаление, медиирано от mtDNA и реактивни кислородни видове (ROS).

Понастоящем ХБН се счита за нискостепенно възпалително заболяване, което може допълнително да насърчи загубата на протеини в скелетните мускули [14]. Освен това се съобщава за повишена протеолитична активност на каспаза-1 в скелетните мускули от туморно-индуцирана кахексия [15]. Освен това, Rawat et al. [16] съобщават за активиране на NALP3 инфламазома в скелетни мускули с дефицит на диферлин и доказват, че освен имунните клетки, скелетните мускулни клетки могат да образуват и инфламазома, когато се стимулират при определени условия. Активирането на NACHT-PYD-съдържащ протеин 3 (NALP3) би могло да привлече асоцииран апоптоза, подобен на петна, съдържащ CARD (ASC) и каспаза-1, което води до каскадата на възпалението.

Добре известно е, че ограничената с протеини диета, като една от основните терапевтични стратегии за ХБН, може да намали гломерулната хипертрансфузия и хиперфилтрация [17]; като има предвид, че терапията с ниско протеинова диета (LPD), допълнена с α-кетокиселини (KA), може да забави прогресията на бъбречното заболяване и да поддържа хранителния статус при пациенти с ХБН [18]. Предишни проучвания от този изследователски екип установиха в проекта за фондация Ketosteril Research Award 2010, че в сравнение с терапията с нормална протеинова диета (NPD) и терапията с LPD, терапията с LPD + KA може да облекчи загубата на скелетни мускули при плъхове с диабетна нефропатия и да подобри морфологичните и функционални аномалии на митохондриите [13]. Освен това беше показано също, че плъховете, лекувани с LPD + KA терапия, имат по-ниско ниво на автофагия в скелетните мускули от тези в нормалните протеинови и LPD групи [12]. Тези открития показват, че терапията с LPD + KA облекчава загубата на скелетни мускули, най-вероятно чрез намаляване на нивата на активирана митофагия.

В предишни проучвания на този изследователски екип е показано, че LPD + KA терапията може да инхибира хроничната възпалителна реакция в бъбречните тъкани [19], но понастоящем няма съобщения за нейните ефекти върху хроничното възпалително състояние на скелетните мускули при ХБН или че Терапията с LPD + KA може да подобри митохондриалната аномалия и да разреши регулирането на автофагията и загубата на скелетни мускули, като се стигне до заключението, че митофагията, като механизъм за адаптивна защита, е способна да намали активирането на възпалителния мускул и следователно да разреши загубата на скелетни мускули чрез премахване и изчистване на анормални митохондрии. Терапията LPD + KA може да разреши загубата на скелетни мускули чрез подобряване на анормалния път на митофагия-възпаление.

Следователно, използвайки плъхове с 5/6 нефректомия като модел на хронична бъбречна недостатъчност, настоящото проучване има за цел да наблюдава промени в митофагията, mtDNA, ROS, инфламазома и други възпалителни фактори в скелетните мускули при ХБН, за да се сравнят ефектите на LPD + KA терапия за подобряване на такива промени и обяснява молекулярния механизъм на LPD + KA терапия за подобряване на загубата на скелетни мускули при ХБН, като по този начин предоставя експериментални доказателства за клинично приложение на LPD + KA терапия при лечение на пациенти с ХБН.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Животни и експериментален дизайн

Изследване на кръв и урина

24-часовите проби от урина бяха събрани в клетки за метаболизъм за анализ на протеини. Кръвни проби бяха събрани, след като животните получиха анестезия за измерване на нивата на серумен албумин, креатинин и урея. Всички анализи бяха извършени според рутинни процедури в Биохимичната лаборатория на Асоциираната първа болница на университета в Шанхай Jiaotong.

ELISA

Концентрациите на цитокини се определят чрез ELISA. Плазмените нива на фактор на некроза на туморен интерлейкин-α (TNF-α), интерлевкин-6 (IL-6), IL-1β и IL-18 бяха анализирани в съответствие с инструкциите на производителя. Сто микролитра от всеки серум се смесва с буфер за анализ и абсорбцията се измерва при 420 nm с помощта на Synergy 2 ELISA четец за плаки (Bio-Tek).

Хистология

Взети са проби от мускули на гастрокнемиус след убиването на животните. Пробите бяха разделени на три групи за оцветяване или с електронен микроскоп (EM), с хематоксилин и с еозин (H&E), или незабавно бяха замразени и държани при –80 ° C за PCR в реално време и анализи на Western blotting.

Предавателен електронен микроскоп (TEM)

За наблюдение от ТЕМ, мускулни проби се фиксират в 2% глутаралдехид в 0,1 М какодилатен буфер. Образците бяха фиксирани в 1% осмиев тетроксид в същия буфер, дехидратирани със степенувана поредица етанол и вградени в епон, както беше описано по-рано [21]. Ултратънките секции бяха оцветени с уранилацетат и оловно цитриран и бяха анализирани с Philips CM120 TEM (FEI).

Хематоксилин и еозин

Мускулните проби се почистват от видима съединителна и мастна тъкан и кръв и след това се претеглят. Гастрокнемиалните мускули бяха фиксирани чрез замразяване в охладен с течен азот изопентан и съхранявани при –70 ° C, както беше описано по-рано [22]. Серийните напречни сечения с дебелина 10 mm бяха оцветени с H&E. Размерите на миофибрите са измерени с помощта на софтуера Image-Pro Plus (Media Cybernetics) и площта на напречното сечение на мускулните влакна (CSA) е изчислена чрез анализ на 50 миофибри на мускул от всеки плъх. CSA на влакната се определя от пет области при увеличение 40 пъти.

Митохондриален мембранен потенциал

Потенциалът на митохондриалната мембрана (MMP) се определя с помощта на JC-1 (5,5 ', 6,6'-тетрахлоро-1,1', 3,3'-тетраетилбензимидазолкарбоцианин йодид) MMP комплект за откриване (Beyotime). JC-1 е катионна флуоресцентна багрилна сонда (зелена като мономер/червена като агрегати), която се натрупва в митохондриите по потенциално зависим начин. Клетките с функционални митохондрии включват JC-1, което води до образуването на JC-1 агрегати, които показват червено спектрално изместване, което води до по-високи нива на червена емисия на флуоресценция, измерена в червените (флуоресценция, FL-2 канал) и зелените мономери (откриваеми в FL-1 канал). Клетките с колабирали митохондрии съдържат предимно зелени JC-1 мономери. Те бяха извършени, както е описано по-горе [23]. Всички стандарти, контроли и проби бяха разчетени в два екземпляра.

Western blot анализ

Лизатите на тъкани се приготвят от проби, замразени в течен азот. Пробите се пулверизират и лизират в буфер за радиоимунопреципитация (RIPA) в продължение на 2 часа при 4 ° С. Лизатите се центрофугират при 10000 ж за 10 минути при 4 ° С и супернатантите се прехвърлят в отделни епруветки. Равни обеми (20 mg) протеин се разделят с помощта на SDS/PAGE и се прехвърлят върху нитроцелулозни мембрани. Мембраните бяха инкубирани за една нощ при 4 ° С в 5% обезмаслено мляко с първични антитела. Използвани антитела са: индуцирана от PTEN предполагаема киназа 1 (PINK1) (Abcam); Паркин (Abcam); LC3 (Abcam); P62 (Abcam); TNF-a (Abcam); IL-6 (Abcam); NALP3 (Abcam); IL-18 (Abcam); ASC (Дядо Коледа); каспаза-1 (Дядо Коледа); IL-1β (Дядо Коледа); GAPDH (глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа; Технология за клетъчна сигнализация). След това мембраните се измиват и инкубират с помощта на вторичен анти-заешки IgG (Beyotime Institute of Biotechnology), антитяло или анти-миши IgG (Beyotime Institute of Biotechnology) или антитяло, конюгирано с пероксидаза от хрян (Beyotime Institute of Biotechnology). Визуализацията на лентата беше извършена с помощта на ECL Western Blotting Substrate kit (Millipore).

ROS на митохондриите се измерва чрез оцветяване с MitoSOX (Invitrogen) (5 μM за 15 минути при 37 ° С). За измерване на митохондриална маса, тъканите се оцветяват с 25 nM MitoTracker Green FM и MitoTracker Deep Red FM (Invitrogen; 15 минути при 37 ° С). Данните бяха получени с поточен цитометър BD FACS Canto II (BD Biosciences) и анализирани с аналитичен софтуер FlowJo (Treestar).

Количествена PCR в реално време

Общо геномна ДНК беше изолирана от мускулни проби с комплекта TIANamp Genomic DNA (Tiangen) съгласно инструкциите на производителя. Относителното ниво на митохондриална ДНК беше измерено чрез извършване на количествена PCR в реално време, извършена в система за откриване на последователност ABI PRISM7300. Бяха проведени две независими реакции с използване на установени праймери за митохондриални и ядрени гени. броят на mtDNA копие беше измерен чрез количествена PCR и нормализиран до нивата на ядрената ДНК в съотношение на ДНК на цитохром с оксидаза 1 (mtCOI) спрямо ядрена ДНК (кодираща 18S рибозомна РНК) [24]. Използвани са следните грундове:

18S напред, 5′-GAGAAACGGCTACCACATCC-3 ′;

18S заден ход, 5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3 ′;

и COI напред, 5′-CATCCTCCATAGTAGAAGC-3 ′;

COI заден ход, 5′-CCTAAGATAGAAGACACCC-3 ′.

За измерване на mtDNA в цитозол, концентрацията на протеин и обемът на супернатантата бяха нормализирани, последвано от центрофугиране при 10000 ж за 30 минути при 4 ° С за получаване на супернатант, съответстващ на цитозолната фракция. ДНК се изолира от 200 μl от цитозолната фракция. Броят на копията на mtCOI ДНК се измерва чрез количествена PCR в реално време, като се използва същия обем от ДНК разтвора.

Статистически анализ

Лечението с кетокиселини може допълнително да подобри протеините в урината и биохимичните параметри

Серумният албумин, биохимичен индикатор в диагностиката на PEW, е силен предиктор за смъртността при пациенти на поддържаща хемодиализа [39]. Серумният албумин е по-нисък в групите с ХБН от контролната група. Сред групите с ХБН групата LPD е по-ниска от групата NPD, групата LPD + KA е по-висока от групата LPD, но разликите не са значителни. Азотът и креатининът в уреята в кръвта са най-високи в групата с NPD и намалени в групата с LPD; групата LPD + KA имаше най-ниските стойности, но разликата не беше значителна сред групите с ХБН. Установено е, че протеинът в урината е най-висок в групата с NPD, значително намален в групата с LPD и най-нисък в групата с LPD + KA (Фигура 2).

Протеини в урината и биохимични параметри на експерименталните групи

Лечението с кетокиселини може допълнително да подобри автофагията/митофагията в мускулите на гастрокнемия

При автофагия-лизозомния път p62 е свързващ убиквитин протеин, който директно се свързва с LC3, за да улесни разграждането на убиквитинираните протеинови агрегати. Имуноблотингът показва, че p62 и LC3 се увеличават в групите с CKD, сред които p62 и LC3 са значително по-високи в групата на NPD от контролната група, но са по-ниски в групата с LPD, въпреки че p62 не се променя значително. В допълнение, добавянето на KA допълнително намалява p62 и LC3, но разликата също не е значителна (Фигури 3A – 3C).

Промяна на автофагия/митофагия в експерименталните групи

Деполяризацията на митохондриите, намаляване на MMP, е маркер за започване на митофагия. Групата NPD показа значително намаляване на MMP от контролната група, LPD може да намали намаляването на MMP, докато LPD + KA може допълнително да намали MMP (Фигура 3D). Както е известно, локализираният в митохондрии PINK1, който обикновено претърпява бързо разграждане, се стабилизира върху външната митохондриална мембрана (OMM), когато митохондриите се деполяризират [40]. Натрупаният PINK1 набира цитозолен паркин към деполяризирани митохондрии, което води до активиране на неговата Е3 активност и след това Паркин убиквитинира митохондриалния субстрат. Фосфорилирането на субстратите чрез PINK1 грундира протеина на OMM, или да взаимодейства с Parkin, като по този начин секвестира цитозолния Parkin в митохондриите или да бъде убиквитиниран от Parkin [41]. Паркин и PINK1 са най-високи в групата на NPD и намаляват в групата на LPD, въпреки че разликата не е значителна. Добавката на KA допълнително намалява Parkin и PINK1 и разликата между NPD групата и LPD + KA групата е значителна (Фигури 3E и 3F).

Що се отнася до ТЕМ изображенията, открихме значително повече автофагозома или автолизозома в групата на NPD, отколкото контролната група, но в групата на LPD автофагозомата или автолизозомата бяха значително намалени и допълнително намалени в групата LPD + KA, като групата LPD + KA беше подобна на контролната група (Фигура 4).