1 Катедри по молекулярна медицина и здраве на жените и децата, Институт Каролинска, Болница Каролинска, 171 76 Стокхолм, Швеция; и Институт по фармакология и терапия, Медицински факултет, 4200 Порто, Португалия

1 Катедри по молекулярна медицина и здраве на жените и децата, Институт Каролинска, Болница Каролинска, 171 76 Стокхолм, Швеция; и Институт по фармакология и терапия, Медицински факултет, 4200 Порто, Португалия

1 Катедри по молекулярна медицина и здраве на жените и децата, Институт Каролинска, Болница Каролинска, 171 76 Стокхолм, Швеция; и Институт по фармакология и терапия, Медицински факултет, 4200 Порто, Португалия

1 Катедри по молекулярна медицина и здраве на жените и децата, Институт Каролинска, Болница Каролинска, 171 76 Стокхолм, Швеция; и Институт по фармакология и терапия, Медицински факултет, 4200 Порто, Португалия

1 Катедри по молекулярна медицина и здраве на жените и децата, Институт Каролинска, Болница Каролинска, 171 76 Стокхолм, Швеция; и Институт по фармакология и терапия, Медицински факултет, 4200 Порто, Португалия

Резюме

По време на високосолената диета ендогенният допамин (DA) намалява транспорта на натриев йеюнал при млади, но не и при възрастни плъхове. Това проучване е предназначено да оцени дали този ефект се медиира на клетъчно ниво чрез инхибиране на активността на Na + -K + -ATPase. Ензимната активност се определя в изолирани йеюнални клетки чрез скоростта на [γ- 32 P] ATP хидролиза. Клетките са получени от отбиване и възрастни плъхове, хранени с диета с високо или нормално съдържание на сол. При 20-дневни, но не и при 40-дневни плъхове активността на Na + -K + -ATPase е значително намалена по време на диета с високо съдържание на сол. Това инхибиране беше премахнато от блокер на синтеза на DA. Намалената активност е свързана с намалена α1-субединица в плазмената мембрана. По време на диета с високо съдържание на сол се наблюдава увеличение на съдържанието на DA в йеюналните клетки от 20-дневни плъхове, свързано с паралелно намаляване на 5-хидрокситриптамин, в сравнение с диетата с нормална сол. При 40-дневни плъхове обаче нивото на катехоламин остава непроменено по време на диета с високо съдържание на сол. Инкубацията на изолирани йеюнални клетки с DA води до дозозависимо инхибиране на активността на Na + -K + -ATPase при 20-, но не и при 40-дневни плъхове. Ние заключаваме, че по време на диета с високо съдържание на сол, Na + -K + -ATPase при 20-дневни плъхове се инхибира и този ефект вероятно ще бъде медииран от местно образуван DA.

наскоро показахме, че абсорбцията на натрий и съдържанието на катехоламин в йеюналната лигавица на млади плъхове са по-високи, отколкото при зрели животни (14). Освен това при млади животни по време на диета с високо съдържание на сол се наблюдава намаляване на абсорбцията на натрий с паралелно повишаване на нивата на допамин в тъканите (DA), докато при възрастни животни няма значителни промени в абсорбцията на натрий, нито в съдържанието на катехоламин в лигавицата на йеюналната тъкан (6, 14). Това проучване предполага, че по време на диета с високо съдържание на сол, повишаването на нивата на йеюнална DA, свързано с намаляване на съдържанието на норепинефрин (NE), е отговорно за контрола на абсорбцията на натрий в йеюналната лигавица на млади животни. Възрастни (на 40 дни) животни не са имали значителна промяна в абсорбцията на натриев йеюнал или в нивата на катехоламини по време на диета с високо съдържание на сол. Липсата на каквато и да е промяна в йеюналната функция в отговор на високосолената диета съвпадна с периода, в който бъбречната функция е достигнала зреене (23, 24), като по този начин се предполага допълнителни функции между червата и бъбреците по време на развитието.

Хомеостазата на натрий и вода е критична стъпка по време на адаптацията към ранния живот; въпреки че нефрогенезата е завършена при раждането, бъбречната тубулна функция продължава да се развива след раждането (23, 24). По време на ранния постнатален живот бъбрекът има ограничен капацитет да регулира течностите и електролитната хомеостаза, което води до висока екскреция на натрий и често до отрицателен натриев баланс и хипонатриемия (30, 31). Чревната функция също се определя от процес на развитие, който оказва голямо влияние не само по време на усвояването на хранителни вещества, но също толкова важно е поддържането на електролитите и водния метаболизъм (17, 32). Следователно разбирането на клетъчните механизми, контролиращи този процес, е от първостепенно значение.

При транспортирането на епитела векториалното движение на натрий се осъществява посредством Na + -K + -ATPase, разположена в базолатералната плазмена мембрана и няколко натриеви транспортни механизма, локализирани в апикалния домейн на клетката (25). В бъбречния епител (проксимални и дистални тубули) на зрели животни DA намалява активността на Na + -K + -ATPase по време на диета с високо съдържание на сол, което се смята, че допринася за повишената екскреция на натрий в урината (3). По този начин настоящото проучване е предназначено да изследва дали DA-зависимото инхибиране на абсорбцията на натрий през лигавицата на йеюналната тъкан на млади животни е свързано с намалена активност на Na + -K + -ATPase.

Всички експерименти са проведени при плъхове Sprague-Dawley (BK Universal, Sollentuna, Швеция), на възраст 20 (отбиване) и 40 (възрастни) дни, с тегло 37,1 ± 1,2 g (н = 8) и 170 ± 3,4 g (н = 8), съответно. Животните се държат в климатизирани помещения за животни, в котила от четири животни на котило. Възрастните плъхове са хранени с обикновена твърда чау-чау (BK Universal); на младите плъхове се даваше същата чау, но омекотена чрез смесване с вода. Водата от чешмата е предоставена ad libitum. Диетичната група с високо съдържание на сол получава като течност 0,9% физиологичен разтвор вместо чешмяна вода. 20-дневните плъхове на диета с високо съдържание на сол получават физиологичен разтвор в продължение на 4 дни, докато 40-дневните плъхове получават физиологичен разтвор в продължение на 7 дни преди проучването. Преди това сме изследвали активността на Na + -K + -ATPase в отговор на високо съдържание на сол (3, 20) и не сме открили разлики между 2 и 7 дни от приема на диета с високо съдържание на сол. Дневният прием на натрий е средно 0,5 и 5,0 mmol/100 g телесно тегло, съответно при групи с нормална и висока сол, съответно.

За да се определи ролята на ендогенния DA, плъховете се инжектират интраперитонеално (0,1 ml) с бензеразид (10 mg/kg телесно тегло; Roche, Базел, Швейцария), инхибитор на ароматната l-аминокиселинна декарбоксилаза (AADC), 1 час преди животни бяха убити. Това лечение беше достатъчно, за да предизвика пълно инхибиране на периферния DA-конвертиращ ензим до 4 часа след приложението (10). Контролните животни се инжектират със същия обем носител (стерилна вода).

Изолация на клетките.

Методът за изолиране на клетки е описан по-горе (18, 22) с незначителни модификации. Накратко, животните бяха умъртвени чрез обезглавяване под анестезия и коремната кухина незабавно беше отворена за изрязване на йеюнален сегмент с дължина ~ 10 cm. Избраният сегмент се поставя върху ледено студена стъклена плоча, нарязва се на по-малки сегменти с дължина .51,5 cm и се изплаква без кръв и чревно съдържание с физиологичен разтвор (0,9% NaCl). Фрагментите на тъканта бяха изпоядени с фини форцепс и инкубирани в продължение на 45 минути в 5 ml топло (37 ° C) и газообразно (95% O2-5% CO2) разтвор на Ханкс с 0,06% колагеназа тип I (Sigma Chemical, St. Louis, MO). В края на инкубационния период препаратът внимателно се завихря, за да позволи епителните клетки да се отделят. След това фрагментите се отстраняват от разтвора и средата, съдържаща отделените клетки, се центрофугира (200 ° С) ж, 4 ° С) за 4 минути. Образуваната клетъчна пелета се суспендира отново в разтвор на Ханкс. Клетъчната жизнеспособност се изчислява чрез метода за изключване на трипан синьо (0,04%, 1 мин.), А процентът на жизнеспособните клетки (с изключение на багрилото) е> 90%, както се определя чрез преброяване на хемоцитометър.

Определяне на активността на Na + -K + -ATPase.

Активността на Na + -K + -ATPase в изолирани клетки в суспензия се определя, както е описано по-горе (2). Накратко, след клетъчна изолация 10-μl аликвотни части (съдържание на протеин ∼5–15 μg протеин) бяха прехвърлени в среда за анализ на Na + -K + -ATPase (краен обем 100 μl), съдържаща (в mM) 50 NaCl, 5 KCl, 10 MgCl2, 1 EGTA, 50 Tris-HCl, 10 Na2ATP (Sigma) и [32 P] ATP (Amersham; специфична активност 3000 Ci/mmol) в проследяващи количества (3.3 nCi/μl). Клетките бяха временно изложени на термичен шок (10 минути при -20 ° С), за да направят плазмената мембрана пропусклива за АТФ. След това пробите се инкубират при 37 ° С в продължение на 15 минути. Реакцията беше прекратена с бързо охлаждане до 4 ° С и добавяне на TCA-въглен (5-10%). След като се отдели въгленната фаза (центрофугиране при 14 000 об/мин за 5 минути), се взема аликвотна част от супернатантата и се отчита освободеното 32 Р. Активността на Na + -K + -ATPase се изчислява като разлика между тестовите проби (обща активност на ATPase) и пробите, изследвани в среда, лишена от Na + и K + и в присъствието на 2 mM уабаин (нечувствителна към уабаин активност на ATPase). Определянето на протеина се извършва съгласно Брадфорд, като се използва конвенционален реагент за оцветяване (Bio-Rad, Richmond, CA).

Анализ на тъканните катехоламини.

Western blot анализ.

Клетките на йеюнал са изолирани от 20- и 40-дневни плъхове, както беше описано по-рано. Клетките се хомогенизират и аликвотни части (50 μg протеин) се анализират чрез SDS-PAGE, като се използва буферната система на Laemmli, както е описано (1). Протеините се прехвърлят в мембрани от поливинилиден дифлуорид (Immobilon-P, Millipore, Bedford, MA) в буфер, съдържащ 25 mM Tris-HCl, 192 mM глицин, SDS, 0,1% (тегл/обем) и 20% метанол (обем/обем) ). Прехвърлянето се извършва при 1 ампер в продължение на 3 часа, използвайки система Transphor (Hoaffer, Сан Франциско, Калифорния). Идентифицирането на протеини се извършва с помощта на моноклонално антитяло срещу α1-субединицата (21; с любезното съдействие на д-р М. Каплан) и α2 и α3 с моноклонално антитяло, любезно предоставено от д-р К. J. Sweadner. Имунореактивността се открива с подобрен комплект за откриване на хемилуминесценция (Amersham), използван точно както се препоръчва от производителя. Измерванията бяха извършени с множество експозиции, за да се гарантира, че сигналите са в линейния диапазон на филма. Сканирането се извършва с помощта на скенер Scan Jet IIc (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA). Всяка лента беше сканирана два пъти в различни региони, сканирането беше осреднено и площта на пика минус фона (в произволни единици) беше количествено определена.

Статистически анализ.

Данните бяха анализирани с помощта на Student’sт-тест. Стойностите са средни стойности ± SE.P l -DOPA в йеюналната лигавица след инхибиране на AADC се изчислява от полулогичен график на нивата на l -DOPA спрямо времето на инхибиране; наклонът на натрупване беше изчислен с помощта на линейна регресия. Фракционното натрупване на l -DOPA (к) след това се получава от израза к = наклон/0,434 (6).

Активността на Na + -K + -ATPase се определя в изолирани йеюнални клетки от 20- и 40-дневни плъхове. Активността на базалния ензим, изследвана при оптимални (максимална скорост) субстратни условия, е 300 ± 85 (н = 8) и 526 ± 51 (н = 5) nmol Pi ⋅ mg протеин -1-1 min -1, съответно. Прилагането на диета с високо съдържание на сол води до значително намаляване на активността на Na + -K + -ATPase при 20-, но не и 40-дневни плъхове (Фиг. 1). Това намаление на 20-дневната активност на Na + -K + -ATPase на плъхове, наблюдавано по време на диета с високо съдържание на сол, е притъпено, когато на бензеразид, инхибитор на AADC, се дава 1 час преди експериментите.

диета

Фиг. 1.Активност на Jejunal Na + -K + -ATPase при 20- и 40-дневни плъхове, хранени с нормална сол (NS), високо сол (HS) или диета-бензеразид с висока сол (HS-Bz). Всяка лента представлява средната стойност ± SE на определянията, извършени независимо и в два екземпляра. Броят в ленти представлява експерименти (без животни), извършени във всяка група.

Наличието на различни Na ​​+ -K + -ATPase изоформи в йеюналните клетки не е било характеризирано по-рано. Така първо определихме кои от изоформите присъстват в йеюналните клетки от 20- и 40-дневни плъхове (фиг. 2) и дали този модел е бил повлиян от диетата с високо съдържание на сол. Изолиран стриатум на плъх се използва като положителна контрола. Докато и трите изоформи присъстват в стриаталните мембрани, плазмената мембрана на йеюналната клетка показва присъствието само на Na + -K + -ATPase α1-изоформа (Фиг. 2). В допълнение, плазмените мембрани, изолирани от йеюнални клетки от 20-дневни плъхове на диета с високо съдържание на сол, показват значително намаляване (% от контрола 74,2 ± 4,8, н = 4) в изобилието на α1-субединица в сравнение с контролите, съответстващи на възрастта, получаващи нормален физиологичен разтвор, докато при 40-дневни животни високото количество сол не влияе върху изобилието на α1-субединицата.

Фиг. 2.Изобилие на Na + -K + -ATPase а-субединица в йеюналната плазмена мембрана от 20- и 40-дневни плъхове, получаващи NS или HS диета. Всяка лента съдържа еднакво количество протеин (18,4 μg), с изключение на Western blots с α3-изоформно антитяло (9,2 μg). Western blots се повтарят 4 пъти (животни). S, стриатум.

Таблица 1. Нива на l -DOPA, NE, DA и 5-НТ в йеюналната лигавица на 20- и 40-дневни плъхове, получаващи нормално солена диета

Стойностите са средни стойности ± SE; н = 6–12 животни/група. 1 -DOPA, 1 -3,4-дихидроксифенилаланин; NE, норадреналин; DA, допамин; 5-НТ, 5-хидрокситриптамин.

* Значително различен от съответните стойности при плъхове на 40 дни (P

Фиг. 3.Допамин (DA) и 5-хидрокситриптамин (5-HT, серотонин) в нива на еюнални епителни клетки на 20-дневни плъхове в NS, HS и HS-Bz групи. Всяка лента представлява средна стойност ± SE от 5 определяния, извършени в два екземпляра. * P


Фиг. 4.Нива на DA и 5-HT в йеюнални епителни клетки на 40-дневни плъхове на NS и HS диета. Всяка лента представлява средна стойност ± SE от 5 определяния, извършени в два екземпляра.


Фиг. 5.Нива на l -3,4-дихидроксифенилаланин (l -DOPA) в йеюналната лигавица на 20- и 40-дневни плъхове при време 0 и 60 минути след приложение на бензеразид (10 mg/kg). Показани са резултати за наблюдения на натрупване на l -DOPA. Всяка точка представлява средната стойност на 8 животни/група; Стойностите на SE бяха

След това изследвахме възможността DA да повлияе на транспорта на течности през чревния епител чрез инхибиране на активността Na + -K + -ATPase. В изолирани клетки от 20-дневни животни, ин витро инкубацията с DA води до концентрационно зависимо инхибиране на активността на Na + -K + -ATPase (Фиг. 6). EC50 за DA-индуцирано инхибиране на Na + -K + -ATPase е ~ 100 nM. DA (1 μM) не успя да инхибира активността на Na + -K + -ATPase в изолирани клетки от плъхове на 40 дни (% от контрола 93,1 ± 3,8, н = 7, без значение).

Фиг. 6.Na + -K + -ATPase активност в йеюнални клетки, които бяха изолирани от отбиващи плъхове и инкубирани in vitro с DA. Клетките се инкубират с различни концентрации на DA в продължение на 15 минути при стайна температура. Всяка стойност представлява средната стойност ± SE на трикратни определяния. Броят на проведените експерименти за всяка концентрация е в скоби.

Тъй като диетата с високо съдържание на сол е свързана не само с повишени нива на DA, но и с намаляване на клетъчното съдържание на 5-HT, следващата оценка е дали инхибиторното действие на DA е повлияно от 5-HT (фиг. 7). Инхибиторният ефект на DA се предотвратява с 1 и 10 μM 5-HT.

Фиг. 7.Инхибиращият ефект на DA върху Na + -K + -ATPase се антагонизира от 5-HT. Изолираните клетки се инкубират с 1 μM DA самостоятелно или в присъствието на 1 и 10 μM 5-HT. Активността на Na + -K + -ATPase се изразява като процент от контрола. Всяка лента представлява средно ± SE от 5 експеримента.

Високосолената диета при млади животни е свързана с намаляване на абсорбцията на натрий и вода в тънките черва (14). Представените тук резултати предполагат, че на клетъчно ниво намалената абсорбция на натрий (векторен транспорт) може да бъде резултат от намалена активност на Na + -K + -ATPase. Освен това, контролът на Na + -K + -ATPase каталитичната активност вероятно ще зависи от ендогенните нива на DA тъкан.

На клетъчно ниво инхибирането на активността на Na + -K + -ATPase от DA може да бъде резултат от намален брой помпени единици в плазмената мембрана, механизъм, може би аналогичен на този, присъстващ в бъбречните епителни клетки (8, 9). Тази гледна точка се подкрепя от констатацията, че плазмените мембрани, изолирани от йеюнални клетки на млади плъхове на диета с високо съдържание на сол, показват паралелно намаляване на изобилието на Na + -K + -ATPase α1-субединица в сравнение с плъхове, съвпадащи с възрастта при нормално- солена диета.

Активността на Na + -K + -ATPase се определя при оптимални концентрации на субстрата (натрий, калий и АТФ), като по този начин се изключва възможността инхибиторният ефект на DA да е вторичен спрямо промените в натриевата пропускливост. Последното обаче не изключва възможността по време на in vivo условия да има и съпътстващо намаляване на апикалната натриева пропускливост, както се съобщава за бъбречния епител (4, 5); едновременното намаляване на апикалната натриева пропускливост и активността на Na + -K + -ATPase би довело до намален векторен транспорт без промени в вътреклетъчния натрий.

Таблица 2. Скорост на използване на l -DOPA в лигавицата на йеюналната тъкан на 20- и 40-дневни плъхове, получаващи нормална и високосолена диета

Стойностите са средни стойности ± SE; н = 5 животни/група.

В заключение, резултатите от това проучване показват, че намалената абсорбция на натрий, наблюдавана при млади плъхове по време на диета с високо съдържание на сол, вероятно се дължи на намалена активност на Na + -K + -ATPase. Това проучване също така демонстрира, че степента на използване на l -DOPA в йеюналните клетки на възрастни плъхове на диета с високо съдържание на сол е по-ниска, отколкото при млади плъхове, и това може да се дължи на намалена наличност на субстрата в вътреклетъчната среда, а не на специфичен дефицит в дейността на AADC.

Благодарни сме на д-р Адриан I. Кац за ползотворни дискусии и конструктивни критики.

СТЪПКИ

Това проучване беше подкрепено с безвъзмездни средства от Шведския съвет за медицински изследвания (A. M. Bertorello) и Fundação para Ciência e a Tecnologia (P. S. Silva). M. A. Vieira-Coelho и V. A. Lucas Teixeira са получатели на стипендии Praxis 21.

Разходите за публикуване на тази статия бяха покрити отчасти чрез плащането на такси за страница. Следователно статията трябва да бъде маркирана с „реклама”В съответствие с 18 U.S.C. §1734 единствено за посочване на този факт.

ПРЕПРАТКИ

ЗАБЕЛЕЖКИ НА АВТОРА

Адрес за заявки за повторно отпечатване: A. M. Bertorello, болница Karolinska, Rolf Luft Center for Diabetes Research L6B: 01, 171 76 Стокхолм, Швеция.