Роли Концептуализация, куриране на данни, формален анализ, разследване, методология, ресурси, софтуер, визуализация, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

влияе

Принадлежности GABI, INRA, AgroParisTech, Университет Париж-Сакла, Жуи ан Жозас, Франция, INRA, UMR1213 Тревопасни животни, Saint Genès Champanelle, Франция, Clermont Université, VetAgro Sup, UMR Herbivores, Клермон-Феран, Франция

Роли Куриране на данни, формален анализ, разследване, методология, визуализация, писане - преглед и редактиране

Партньорство GABI, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, Франция

Роли Куриране на данни, формален анализ, разследване, методология, софтуер, писане - преглед и редактиране

Партньорство GABI, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, Франция

Роли Формален анализ, разследване, писане - преглед и редактиране

Партньорство GABI, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, Франция

Роли Формален анализ, разследване, писане - преглед и редактиране

Партньорство GABI, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, Франция

Роли Формален анализ, разследване, писане - преглед и редактиране

Принадлежности INRA, UMR1213 Растителноядни животни, Saint Genès Champanelle, Франция, Clermont Université, VetAgro Sup, UMR Herbivores, Clermont-Ferrand, Франция

Допринесе еднакво за тази работа с: Fabienne Le Provost, Christine Leroux

Роли Концептуализация, придобиване на финансиране, администриране на проекти, ресурси, надзор, валидиране, визуализация, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Партньорство GABI, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, Франция

Допринесе еднакво за тази работа с: Fabienne Le Provost, Christine Leroux

Роли Концептуализация, придобиване на финансиране, администриране на проекти, ресурси, надзор, валидиране, визуализация, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Принадлежности INRA, UMR1213 Тревопасни животни, Saint Genès Champanelle, Франция, Университет Клермон, VetAgro Sup, UMR Тревопасни животни, Клермон-Феран, Франция

  • Lenha Mobuchon,
  • Сандрин Льо Гийо,
  • Силвен Марти,
  • Йохан Лаубие,
  • Денис Лалое,
  • Себастиен Бес,
  • Fabienne Le Provost,
  • Кристин Леру

Фигури

Резюме

Цитат: Mobuchon L, Le Guillou S, Marthey S, Laubier J, Laloë D, Bes S, et al. (2017) Добавянето на слънчогледово масло влияе върху експресията на miR-20a-5p и miR-142-5p в лактиращата млечна жлеза на говеда. PLoS ONE 12 (12): e0185511. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0185511

Редактор: Хуан Дж. Лоор, Университет на Илинойс, САЩ

Получено: 27 април 2017 г .; Прието: 14 септември 2017 г .; Публикувано: 27 декември 2017 г.

Това е статия с отворен достъп, без никакви авторски права, и може да бъде възпроизвеждана, разпространявана, предавана, модифицирана, надграждана или използвана по друг начин от всеки за каквато и да е законна цел. Произведението е предоставено на базата на Creative Commons CC0, посветена на публичното достояние.

Наличност на данни: Всички последователности, описани в тази статия, могат да бъдат изтеглени. RNA-seq данни от секвенсора Hiseq2000 са представени в хранилището на GEO. Те се присвояват под номера за присъединяване GSE81616.5.

Финансиране: Тази работа получи подкрепа от INRA, ApisGène (http://www.apis-gene.com/, безвъзмездни средства по проекта NutriMirMa за LM) и AIP BioRessources.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Последните данни показват, че биоактивните хранителни компоненти (микро- и макронутриенти) влияят върху профила на експресия или функцията на miRNAs [36–40]. Например в ретроперитонеалната мастна тъкан на мишки лечението с конюгирана линолова киселина модифицира експресията на miR-103, miR-107, miR-143, miR-221 и miR-222 и тяхната експресия е свързана с гени, които са силно изразени в адипоцитите и свързани с липидния метаболизъм [41]. При преживните животни малко изследвания са изследвали влиянието на храненето върху експресията на miRNA. Ромао и колеги показаха, че експресията на осем miRNAs в задните мазнини и околоплодната мазнина на бичовете е силно повлияна от диета с високо съдържание на мазнини [42]. Съвсем наскоро се съобщава, че експресията на 11 miRNAs в подкожната и висцералната мастна тъкан на агнета е засегната от промяна на брашно от водорасли от ленено масло [43]. Налични са много малко данни за хранителната регулация на експресията на miRNA в млечната жлеза. Първоначално проучване на нутригеномиката съобщава за модификация на експресията на 30 miRNAs чрез ограничаване на храната при лактиращи кози [44]. Съвсем наскоро Li и колегите му [45] показаха, че експресията на 14 и 22 miRNAs в млечната жлеза на лактиращи крави е била повлияна съответно от лечения и шафран.

Материали и методи

Декларация за етика и животни

Трансфекция на клетки

Изолиране на РНК

Пробите от РНК се приготвят от 50 mg млечна тъкан, като се използва изолационният комплект Nucleospin® miRNA (Machery-Nagel, Inc.), както се съобщава от Le Guillou et al. [13]. РНК се утаяват с използване на 3М натриев ацетат, 96% етанол и 5 mg/ml гликоген. За проби от РНК, приготвени от клетъчни култури, клетките се изплакват с PBS и след това РНК се екстрахират с помощта на комплекта RNA Now (Ozyme) съгласно инструкциите на производителя и включително утаяване през нощта, за да се гарантира максимален добив на miRNA. Концентрацията и чистотата на РНК са оценени чрез спектрофотометрия (NanodropTH, ND-1000).

Подготовка на библиотеката, последователност и обработка на данни

Последователността с висока пропускателна способност беше извършена на две LF и две LF-SO библиотеки. РНК от две крави са обединени, за да генерират всяка библиотека. Пуловете бяха получени при използване на равни количества (10 μg) РНК, извлечени от млечните тъкани на две крави, избрани произволно. Техниките за подготовка на библиотеката и техники за секвениране са описани в Le Guillou et al. [13]. Накратко, библиотеките бяха подготвени с помощта на малък комплект РНК на Illumina с РНК, изолирана от млечната жлеза, последвано от секвениране на Illumina HiSeq 2000 от GATC биотехнологична компания (Next Gen Lab) съгласно метода на секвениране Solexa. След това данните за RNA-seq бяха анализирани главно с помощта на софтуера miRDeep2 [49] и описани в Le Guillou et al. [13].

Обратна транскрипция и количествена PCR

Обратната транскрипция на miRNA е извършена върху осем miRNA, избрани според тяхното изобилие в данни за последователност с висока производителност, тяхната вътрешногрупова стабилност и тяхната промяна в гънките (S1 таблица): miR-15a-5p (TaqMan® ID 005892_mat, Applied Biosystems), miR-17-5p (TaqMan® ID 002308), miR-20a-5p (TaqMan® ID 00580), miR-33a-3p (TaqMan® ID Custom Assay), miR-126-3p (TaqMan® ID 008451_mat), miR -142-5p (TaqMan® ID 000465), miR-181a-5p (TaqMan® ID 000480), miR-223-3p (TaqMan® 002295). Обратната транскрипция и количествената PCR (qPCR) се извършват, като се използват съответно анализите за обратна транскрипция TaqMan® MicroRNA и TaqMan® Small RNA (Applied Biosystems), както е описано в Mobuchon et al. [21].

За генни анализи от клетъчни култури беше извършена обратна транскрипция на 500 ng обща РНК, като се използва SuperScript® VILO cDNA Synthesis kit съгласно инструкциите на производителя (Invitrogen) и при следните условия: 42 ° C за 60 минути и 85 ° C за 5 минути. Количествени PCR цикли са постигнати, като се използва ABsolute Blue QPCR Mix, SYBR Green® (Thermo Scientific ™), съгласно инструкциите на производителя, върху система Mastercycler Ep Realplex (Eppendorf), при следните условия: 95 ° C за 15 минути, 45 цикъла от 95 ° C за 15 секунди и 60 ° C за 1 минута и крива на топене. Получените прагови цикли за ELOVL6 (F 5'-CAATATTTTCCCAGGGTTCTCC-3 'и R 5'-AGCTGCCCTTTCAAGAGTTG-3') и TWF1 (F 5'-GGCATCCAAGCAAGTGAAGA-3 'и R 5'-GCTTCCTACACCAACCACCAGCCCACCA стойности на GAPDH (GlycerAldehyde-3-Phosphate DeHydrogenase F 5'-ATGGTGAAGGTCGGAGTGAA-3 'и R 5'-ACGATGTCCACTTTGCCAGA-3'), а резултатите бяха изразени като кратни промени на стойностите на праговия цикъл (Ct) спрямо контролата, използвайки контролата 2-ΔΔCt метод [50].

Статистически анализ

Статистическият анализ за сравнение на miRNomes е извършен с помощта на R версия 3.0.1 (R Development Core Team, 2013) с пакета Bioconductor DESeq2 [51], както е описано от Le Guillou et al. [13]. Данните бяха филтрирани с помощта на пакета за биопроводници HTSFilter [47]. Този метод има за цел да идентифицира прага, който максимизира сходството на филтрирането между биологичните реплики, или с други думи, че когато повечето гени са склонни да имат или нормализиран брой, по-малък или равен на граничната точка във всички проби (т.е. филтрирани гени) или по-висок от граничната точка в поне една проба (т.е. нефилтрирани гени). Установено е, че тази прагова стойност е равна на 199. p-стойностите са коригирани за многократно тестване, използвайки метода на Benjamini-Hochberg [52], и тези с коригирана p-стойност.

Кравите са получавали диета с ниско съдържание на фураж (LF) или същата диета, допълнена с 4% слънчогледово масло (LF-SO).

Пакетът HTSFilter [54] беше приложен за премахване на miRNA, която изглежда генерира неинформативен сигнал чрез идентифициране на праг на филтриране, който максимизира така нареченото сходство на филтрирането между репликите. След този филтър броят на miRNAs беше намален до 272 (допълнителна таблица S1). Сред тях 18 бяха предсказани miRNAs, които не бяха идентифицирани в нито един вид и следователно могат да се разглеждат като потенциални нови miRNA [13].

Вариации в miRNome на млечната жлеза на говедата като функция на добавката на слънчогледово масло

Анализите бяха извършени на 2 РНК пула от 2 крави, получили диета LF или LF-SO, получена чрез подходи qPCR и NGS. Кравите са получавали диета с ниско съдържание на фураж (LF) или същата диета, допълнена с 4% слънчогледово масло (LF-SO), n = 2.

Проведени са RT-qPCR анализи от 11 крави, получили диета LF или LF-SO. Кравите са получавали диета с ниско съдържание на фураж (LF) или същата диета, допълнена с 4% слънчогледово масло (LF-SO). ** 0,01

miR-20a-5p и miR-142-5p се предвиждат да насочват гени, диференцирано експресирани от слънчогледово масло

За да се изследва функционалната роля на miR-20a-5p и miR-142-5p, бяха използвани изчислителни приложения за прогнозиране на техните цели. Сред стоте потенциални цели някои гени са участвали в липидния метаболизъм (Таблица 2) и в общите регулаторни пътища (Фигура 3).

ABCA1: ATP-Binding Cassette subfamily A (ABC1) member1, BTN1A1: BuTyrophiliN subfamily 1, member A1, LPIN1: LiPIN1, PPARγ: Peroxisome Proliferator-Activation Receptor-Gamma, PPARGC1B: Peroxisome Proliferator-Activator SCD-Activator SCD-1 -CoA Desaturase, VLDLR: Липопротеинов липазен рецептор с много ниска плътност.

По-рано бяха открити различни експресирани гени (DEG) в същите проби, използвайки транскриптомни анализи [46]. Класификацията на DEG във функционални категории (след анотация на генната онтология) идентифицира три класа гени, участващи в метаболизма, съдържащи 30% от DEG, подчертавайки ефекта на слънчогледовото масло върху метаболизма на млечната жлеза, включително липидния метаболизъм. Изследвани са приложими цели на miR-20-5p и miR-142-5p сред тези DEG. Сред предполагаемите цели, показващи обратни отговори на лечението в сравнение с miRNA данни, бяха подчертани девет DEG (Таблица 3). Установено е, че регулираният надолу miR-20a-5p потенциално е насочен към осем регулирани нагоре DEG (ELK4 (ETS транскрипционен фактор), ELOVL6 (елонгаза на мастна киселина 6), ETV1 (ETS вариант 1), KDM6B (лизин деметилаза 6B), KIAA1524, Установено е, че LONP2 (lon peptidase 2, peroxisomal), M6PR (маноза-6-фосфатен рецептор, зависим от катиона), USP12 (убиквитин специфична пептидаза 12) в LF-SO крави и miR-142-5p потенциално са насочени към четири регулирани нагоре DEG (ELK4, ELOVL6, ETV1, PIK3CD (фосфатидилинозитол 3-киназа каталитичен делта полипептид)). И двете miRNAs потенциално насочени ELK4, ETV1 и по-специално ген ELOVL6, който кодира елонгаза на мастни киселини, ензим, участващ в липидния метаболизъм (Фигура 4).

Влияние на miR-20a-5p и miR-142-5p върху експресията на ELOVL6, ген, участващ в липидния метаболизъм