Скоро Сенг Нг

1 Отдел по гастроентерология и хепатология, Катедра по медицина,

2 Катедра по микробиология и имунология, Медицински факултет на Станфордския университет, Станфорд, Калифорния, САЩ.

3 Училище за материалознание и инженерство, Технологичен университет Nanyang, Сингапур, Сингапур.

Anming Xiong

1 Отдел по гастроентерология и хепатология, Катедра по медицина,

2 Катедра по микробиология и имунология, Медицински факултет на Станфордския университет, Станфорд, Калифорния, САЩ.

Хан Нгуен

1 Отдел по гастроентерология и хепатология, Катедра по медицина,

2 Катедра по микробиология и имунология, Медицински факултет на Станфордския университет, Станфорд, Калифорния, САЩ.

Мерилин Масек

1 Отдел по гастроентерология и хепатология, Катедра по медицина,

2 Катедра по микробиология и имунология, Медицински факултет на Станфордския университет, Станфорд, Калифорния, САЩ.

4 Катедра по патология, Медицински факултет на Станфордския университет,

Da Yoon No

1 Отдел по гастроентерология и хепатология, Катедра по медицина,

2 Катедра по микробиология и имунология, Медицински факултет на Станфордския университет, Станфорд, Калифорния, САЩ.

5 Катедра по биоинженерство, Станфордски университет, Станфорд, Калифорния, САЩ.

Менаше Елазар

1 Отдел по гастроентерология и хепатология, Катедра по медицина,

2 Катедра по микробиология и имунология, Медицински факултет на Станфордския университет, Станфорд, Калифорния, САЩ.

Еял Штейер

6 Катедра по детска гастроентерология и хранене, Медицински център Шааре Зедек, Йерусалим, Израел.

Марк А. Зими

1 Отдел по гастроентерология и хепатология, Катедра по медицина,

2 Катедра по микробиология и имунология, Медицински факултет на Станфордския университет, Станфорд, Калифорния, САЩ.

Ейми Воедиш

7 Катедра по акушерство и гинекология,

Кейт Шоу

7 Катедра по акушерство и гинекология,

Шейх Тамир Рашид

1 Отдел по гастроентерология и хепатология, Катедра по медицина,

2 Катедра по микробиология и имунология, Медицински факултет на Станфордския университет, Станфорд, Калифорния, САЩ.

Къртис У. Франк

8 Департамент по химическо инженерство, Станфордски университет, Станфорд, Калифорния, САЩ.

Нам Джун Чо

3 Училище за материалознание и инженерство, Технологичен университет Nanyang, Сингапур, Сингапур.

Джефри С. Глен

1 Отдел по гастроентерология и хепатология, Катедра по медицина,

2 Катедра по микробиология и имунология, Медицински факултет на Станфордския университет, Станфорд, Калифорния, САЩ.

Свързани данни

Резюме

Въведение

Краен стадий на чернодробно заболяване (ESLD) е основна причина за световно заболеваемост и смъртност. Трансплантацията на черен дроб е единственото налично лечение, въпреки че има нарастваща разлика между необходимостта от чернодробна трансплантация или терапии за заместване на клетки и наличното донорно снабдяване (1). Вирусните инфекции, като например от вируса на хепатит С (HCV), са важна етиология на ESLD. Наличието на инженерни човешки чернодробни тъкани би било от голяма полза за увеличаване на възможностите за трансплантация, както и за потенциални устройства за подпомагане на черния дроб, които биха могли да служат като мост към трансплантацията.

Черният дроб също е ключов орган за преработка на лекарства, а хепатотоксичността е основна причина за лекарствена недостатъчност - често се открива късно в процеса на развитие, понякога с драматични последици (2). Най-мощната или токсична форма на съединение може да не е основното съединение, а по-скоро един от неговите метаболити (3). Освен това, първичният in vivo метаболит на дадено съединение може да варира драстично в зависимост от животинския вид, в който се оценява (4). Способността за точно прогнозиране на специфичния за човека метаболизъм на лекарствата и хепатотоксичността е от съществено значение за по-ефективно и по-безопасно разработване на лекарства. За съжаление, настоящите предклинични животински регулаторни видове не са в състояние да открият специфични за човека лекарствени метаболити или хепатотоксичност. Докато културите от човешки чернодробни клетки могат да помогнат да служат на тази цел, скоро след полагането им в стандартна двумерна култура, първичните човешки чернодробни клетки бързо губят характеристиките си на напреднала диференциация, като експресията на ензими, метаболизиращи лекарството на цитохром Р450 (CYP) или способност да поддържа инфекция с естествени човешки вируси на хепатит (5). Чернодробните клетъчни линии, които се получават от човешки чернодробни тумори, обикновено също са загубили тези ключови маркери на предишното си диференцирано състояние.

Резултати

Изработка на 3D хексагонално разположени лобуларни човешки чернодробни тъкани.

дългосрочна

(A) Схематична илюстрация на производството на обърнати колоидни кристали (ICC) скеле. (Б.) Свободностояща колоидна кристална решетка и (° С) полученият ICC с взаимосвързани прозорци, обозначени със стрелки и гръбнак на ICC, обозначени със звездички. Морфология на общите чернодробни клетки на плода в Col-I ICC (д) при засяване и (Е.) 2 седмици след засяването. (F) Изображение с електронно микроскопично сканиране с променливо налягане, показващо клъстери от чернодробни тъкани с висока взаимосвързаност в различни ICC нива. (G и З.) Имунофлуоресцентно изобразяване на инженерни чернодробни тъкани 2 седмици след засяване за албумин (червен) и DAPI (син), костиращ с (G) CK19 (зелен) или (З.) виментин (зелен). (Аз) Натрупване на холил-L-лизил-флуоресцеин (CLF) в чернодробните тъкани след 40 минути CLF инкубация, последвано от 40 минути измиване. (J-L) Имунохистологични изображения, демонстриращи хетерогенни популации в инженерните тъкани, оцветени за албумин (J), CK19 (К) и CD68 (L). Скала: 100 μm.

Продължителна метаболизираща активност на цитохром Р450 в инженерните човешки чернодробни тъкани.

FTLCs във всички платформи бяха третирани с 10 μM клемизол в посочените часови точки за 24 часа. Супернатантите на третираните култури се събират в края на третирането, за да се измери производството на метаболит М1, използвайки LC/MS. Данните са средни ± SD с поне 5 биологични повторения. Десният панел показва основния човешки метаболит на клемизол, M1, който се генерира предимно от CYP3A4.

Инфекция с получен от пациент HCV инокулум и оценка на антивирусната активност.

Паралелни култури от фетални общо чернодробни клетки (FTLCs) в Col-I ICC се инокулират с инокулум на вируса на хепатит С (HCV) на ден 9 след засяване. На 4 часа след инокулацията вирусът се отстранява, културите се промиват 5 пъти с PBS и се добавя прясна среда; пробите бяха събрани преди и след измиване на посочените интервали за qPCR анализ на HCV РНК. Един набор от култури е третиран с 1 μM софосбувир на 11-ия ден след инокулация (червено проследяване; лечение с наркотици, обозначено със стрелка), докато друг набор е третиран само с носител (черен проследяване). Данните са средни ± SD с 5 биологични повторения.

Проектираните човешки чернодробни тъкани предсказват фатална специфична за човека хепатотоксичност на лекарството.

И накрая, ние вярваме, че тези проектирани човешки чернодробни тъкани могат да осигурят нова система за изследване на други досега трудни за моделиране важни човешки чернодробни заболявания, като първичен или метастатичен рак на черния дроб и чернодробни маларийни инфекции, и може да се окажат полезни за бъдещи чернодробни помощни устройства или терапии за заместване на клетки. В обобщение, ние описваме лесно мащабируем 3D модел на човешка чернодробна култура с високо приспособими компоненти. Той може да покаже ключови характеристики на напредналата диференциация на черния дроб на човека за продължителни периоди от време, което трябва да бъде полезно за подобряване на усилията за откриване и разработване на лекарства, подобряване на регулаторната оценка на безопасността на кандидат-лекарството и изучаване на нормални и патогенни процеси, зависими от запазен автентичен човешки черен дроб функция.

Методи

Клетки, хранителни среди и химикали.

HUVECs и HepG2 са закупени от ATCC и е потвърдено, че не съдържат микоплазма. Средата за растеж на FTLCs е съставена от DMEM, допълнена с инсулин, трансферин, селен (ITS +) премикс (BD Pharmingen), 1 × 10 –7 М дексаметазон, 10 тМ никотинамид, 0,5 тМ 2-фосфат аскорбинова киселина, 4 тМ L -глутамин, 0,1 mg/ml хепарин, 5% FBS, 100 U/ml пеницилин G и стрептомицин и 20 ng/ml епителен растежен фактор. Всички клетки се култивират в овлажнен 5% въглероден диоксид, 95% въздушен инкубатор при 37 ° С. Всички химикали и регенти са закупени от Sigma Chemical, освен ако не е посочено друго.

Изработка на обърнато колоидно кристално хидрогелно скеле.

Изолиране на човешки фетални чернодробни клетки.

Човешки фетален черен дроб (14–22 седмици) е закупен от Advanced Biosciences Research Inc. или е доставен от Университетската болница и клиники в Станфорд в съответствие с всички университетски, щатски и федерални разпоредби. Билиарното дърво и съдовите клони на чернодробната тъкан първо бяха отстранени с помощта на скалпел и пинсета. След това черният дроб се смила на по-малки парчета и се усвоява два пъти с 0,6% колагеназа IV с 0,03% DNase I в HBSS за 30 минути при 37 ° С. Разградената тъкан се филтрира през 70-милиметрова найлонова мрежа за отстраняване на мазнини и клъстери. След това филтрираните клетки се центрофугират два пъти при ниска скорост с PBS, за да се отстранят хематопоетичните клетки в супернатантата от общата популация. За да се изчерпят фибробластоподобните клетки в общите човешки фетални чернодробни клетки, клетъчната популация се прилага допълнително към градиент на Ficoll-Paque и се центрофугира (Amersham Biosciences, GE Healthcare) в продължение на 30 минути при 4 ° C при 980 g. Получените клетки се определят като човешки FTLC.

ТЕМ анализ.

Пробите се фиксират с разтвор, съдържащ 2% параформалдехид и 2,5% глутаралдехид в натриев какодилатен буфер. След това пробите се фиксират в 2% осмиев тетроксид и се дехидратират, като се използват етилов алкохолен ред и пропиленов оксид. След това пробите бяха инфилтрирани с епонова смола и вградени, след което дебели секции и оцветени с толуидиново синьо, тънки секции и оцветени с уранил ацетат и оловен цитрат. Решетките бяха разгледани с помощта на трансмисионен електронен микроскоп Hitachi 7650.

Имунофлуоресценция и IHC анализ.

ICC пробите се фиксират за една нощ в буфериран 4% параформалдехид. Пробите се третират през нощта с 2% Triton-X100 (Sigma-Aldrich) в PBS при стайна температура. Пробите първо се изплакват с PBS, след което се обработват с 0,3% водороден прекис в продължение на 5 минути. Впоследствие пробите бяха блокирани с 2% Triton-X100 и 10% FBS за 1 час и след това инкубирани с първично антитяло (срещу албумин [Bethyl, A80-129A], цитокератин 19 [Abcam, ab52625] или виментин [Abcam, ab24525]) една нощ при 4 ° C. Пробите се измиват с PBS и се инкубират във вторично антитяло (Alexa Flour 647 магарешки анти-кози IgG [Abcam, ab150131], Alexa Flour 594 магарешки анти-заешки IgG [Abcam, ab150076] или FITC магарешки анти-пилешки IgY [Abcam, ab63507 ]) през нощта при 4 ° C, последвано от визуализация с конфокален образен микроскоп (Operetta, Perkin Elmer), снабден с широкоформатна sCMOS камера и софтуер за анализ на високо съдържание Harmony (Perkin Elmer).

Проучвания за метаболизма на лекарството in vitro.

Първичните съединения и техните съответни основни метаболити са идентифицирани и характеризирани от MS (Agilent Technologies), снабдени с електроспрей йонизационен източник, по същество, както е описано (23). Накратко, нагрятата капилярна температура в източника се поддържа на 325 ° C. Бяха събрани пълни сканиращи (m/z 110-1000) спектри или зависими от данни спектри MS/MS. Метаболитите са идентифицирани на базата на предизвиканото от сблъсък дисоциационно поведение при МС/МС, точна маса и време на задържане. Количественият анализ на съединенията беше извършен с помощта на калибрационна крива при 1000 ng/ml от вътрешен стандарт 1- (р-бромобензил) -2- (1-пиролидинилметил) -бензимидазол.

HCV инфекция със серуми от пациенти, заразени с HCV.

Пациентските серуми се филтрират и концентрират, като се използва центробежен филтър с размер на порите от 100 000 граници на номинално молекулно тегло (Merck Milipore). Титърът на HCV се определя чрез qPCR. Общата РНК се екстрахира и пречиства чрез TRIzol РНК Изолационни реактиви (Invitrogen) съгласно инструкциите на производителя. СДНК от първа верига е синтезирана с помощта на комплект с голям капацитет РНК-к-ДНК (Invitrogen). Количеството на HCV РНК копие е определено количествено с помощта на iTaq Universal Probes One-Step Kit (Bio-Rad). Праймерите 5 ′ - CTTCACGCAGAAAGCGTCTA - 3 ′ и 5 ′ - CAAGCACCCTATCAGGCAGT - 3 ′ бяха използвани за усилване на HCV РНК, а 6-FAM-TATGAGTGTCGTGCAGCCTC-MGB-NFQ (Applied Biosystems) беше използван като вътрешна проба. Измерването в реално време на PCR продуктите се извършва със система за реално време CFX96, C1000 Touch Therm Cycler (Bio-Rad). Клонът J6/JFH HCVcc генотип 2а е подарък от Чарлз Райс, Университет Рокфелер, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ.

FIAU-индуцирани тестове за хепатотоксичност.

Цитотоксичността се измерва чрез анализ на изтичане на LDH (CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay, Promega). Производството на L (+) - лактат се наблюдава с помощта на търговски комплект за анализ в съответствие с инструкциите на производителя (Abcam). Чернодробна специфична функция се измерва чрез анализ на албумин ELISA (Bethyl). Възпалителният цитокин е измерен чрез IL-6 човешки ELISA комплект (Invitrogen). Клетъчната некроза и митохондриалната функция бяха измерени с помощта на митохондриален анализ ToxGlo (Promega) в края на лечението.

Статистика.

Данните бяха анализирани с помощта на софтуера Prism 6 (GraphPad Sofware Inc.) и показани в средна стойност ± SD. Сравненията по двойки между експериментални и контролни групи бяха направени, като се използва сдвоени или несдвоени 2-опашен тест на Student's t, както е подходящо. Проверено е, че разликата между групите за сравнение е еквивалентна. Бяха направени множество групови сравнения, използвайки еднопосочен ANOVA, последван от пост теста на Dunnett. Размерът на пробата е предвиден от предварително публикувани изследвания и от пилотни експерименти, проведени в лабораторията. Освен ако не е посочено друго, P (14M, pdf)

Благодарности

Това изследване беше подкрепено от награда за клинични учени в транслационните изследвания (JSG) на Фондация „Бъроуз“; Национална изследователска фондация (NRF-NRFF2011-01) и Националният съвет за медицински изследвания (NMRC/CBRG/0005/2012) (NJC); Националните здравни институти R01AI099245 (JSG) и U19AI109662 (JSG); и награда за завършено обучение на Фулбрайт (DYN).

Бележки под линия

Конфликт на интереси: Авторите са декларирали, че не съществува конфликт на интереси.