Институт за стареене и Алцхаймер и Изследователски институт ANZAC, Университет в Сидни и болница Конкорд, Сидни, Австралия;

Център Чарлз Пъркинс, Университет в Сидни, Сидни, Австралия;

Институт за стареене и Алцхаймер и Изследователски институт ANZAC, Университет в Сидни и болница Конкорд, Сидни, Австралия;

Фармацевтичен факултет, Universiti Teknologi MARA, Бандар Пунчак Алам, Селангор, Малайзия;

Институт за стареене и Алцхаймер и Изследователски институт ANZAC, Университет в Сидни и болница Конкорд, Сидни, Австралия;

Център Чарлз Пъркинс, Университет в Сидни, Сидни, Австралия;

Център Чарлз Пъркинс, Университет в Сидни, Сидни, Австралия;

Училището по математика и статистика, Университет в Сидни, Сидни, Австралия;

Институт за стареене и Алцхаймер и Изследователски институт ANZAC, Университет в Сидни и болница Конкорд, Сидни, Австралия;

Институт за стареене и Алцхаймер и Изследователски институт ANZAC, Университет в Сидни и болница Конкорд, Сидни, Австралия;

Институт за стареене и Алцхаймер и Изследователски институт ANZAC, Университет в Сидни и болница Конкорд, Сидни, Австралия;

Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, Universidad Pablo de Olavide CSIC, CIBERER-Instituto de Salud San Carlos III, Carretera de Utrera Km 1, Севиля, Испания;

Институт за стареене и Алцхаймер и Изследователски институт ANZAC, Университет в Сидни и болница Конкорд, Сидни, Австралия;

Център за клинични изследвания и образование, Университетска болница в Северна Норвегия, Тромсе, Норвегия;

Институт за стареене и Алцхаймер и Изследователски институт ANZAC, Университет в Сидни и болница Конкорд, Сидни, Австралия;

Катедра по сърдечно-съдови науки, Университет в Лестър, Британска фондация за сърдечно-съдови изследвания, Лестър, Великобритания;

Катедра по патология, Университет в Отаго и отдели по хирургия, гастроентерология и медицина, Здравен съвет на окръг Кентърбъри, Крайстчърч, Нова Зеландия; и

Център Чарлз Пъркинс, Университет в Сидни, Сидни, Австралия;

Център Чарлз Пъркинс, Университет в Сидни, Сидни, Австралия;

Училище за молекулярна биология, Университет в Сидни, Сидни, Австралия

Център Чарлз Пъркинс, Университет в Сидни, Сидни, Австралия;

Институт за стареене и Алцхаймер и Изследователски институт ANZAC, Университет в Сидни и болница Конкорд, Сидни, Австралия;

Център Чарлз Пъркинс, Университет в Сидни, Сидни, Австралия;

Адрес за заявки за повторно отпечатване и друга кореспонденция: D. G. Le Couteur, болница CERA Concord, Сидни 2139, Австралия (имейл: [имейл защитен]).

Резюме

Ние демонстрираме връзка между диетата, чревния микробиом и фенестрациите на синусоидалния ендотел на черния дроб. Фенестрациите се реорганизират в отговор на диетата, потенциално във връзка със състава и активността на чревния микробиом. Ефектите от диетата и микробиома върху фенестрациите имат значително въздействие върху функцията на черния дроб в напреднала възраст.

Броят и размерът на фенестрацията се променят чрез гладуване (27), ограничаване на калориите (16) и след излагане на биоактивни молекули от чревен бактериален произход, които се доставят през порталната вена директно до черния дроб (5). Тези свойства предполагат, че фенестрациите се реорганизират в отговор на диетата, потенциално във връзка с ефектите от диетата върху състава и активността на чревния микробиом. Следователно в това проучване ние определихме резултатите от излагането на различни хранителни макронутриенти и приема на калории при фенестрации в напреднала възраст. Черният дроб е изследван от голяма кохорта от 15-месечни мишки, които са били хранени ad libitum 1 от 25 диети, вариращи в количествата протеини, мазнини, въглехидрати и енергийна плътност, за да се изследва връзката между енергийния прием, макронутриентите, стареенето, и продължителност на живота (22, 34, 35). В допълнение към пряката роля на отделните макронутриенти върху фенестрациите, ние успяхме да изследваме ефекта от индуцираните от диетата промени в популациите на получени от червата бактерии и циркулиращи метаболити върху структурната цялост на LSEC като потенциални механизми, свързващи диетата и фенестрациите.

Животни.

Мишките и диетичните интервенции са описани по-рано (22, 34, 35). Накратко, C57BL/6 мъжки и женски мишки (н = 858) се хранят ad libitum 1 от 25 диети с различно съдържание на протеини, въглехидрати и мазнини с обща енергия, променена чрез добавяне на несмилаема целулоза. Всички протоколи са одобрени от местния здравен комитет за хуманно отношение към животните в Сидни (Протокол № 2009/003).

Вземане на тъкани и кръв.

На 15 месечна възраст една трета от животните бяха евтаназирани под кетамин и ксилазин анестезия за събиране на тъкани. Непосредствено преди определянето на телесния състав на евтаназията с помощта на GE PIXImus2 Series Densitometer (34). Чернодробната тъкан се събира за сканираща електронна микроскопия и се анализира, както е описано по-рано (8). Ендотелната порьозност е процентът на ендотелната повърхност, перфорирана от фенестрации и се изчислява от диаметъра и честотата им. Циркулиращите аминокиселини са анализирани от Австралийския инструмент за анализ на протеоми, а свободните мастни киселини са анализирани от Metabolomics Australia, докато инсулинът и лептинът са измерени чрез ELISA (ALPCO Diagnostics).

Чревен микробиом.

Съдържанието на цекума се събира, метагеномната ДНК се възстановява и се взема проба от микробната общност чрез 454 секвениране на 3′-края на 16S рибозомната РНК (907–1492), като се използват праймери, специфични за доменните бактерии (18). Четенията на последователността бяха разпределени към оперативни таксономични единици при 97% идентичност и след това бяха класифицирани, използвайки както QIIME, така и Mothur (4, 31).

Статистика.

Ефектите от приема на макронутриенти върху фенестрациите са анализирани с помощта на подхода Geometric Framework, като променливите на реакцията са монтирани като повърхности за реакция върху масивите за прием на макроелементи (протеини, въглехидрати и мазнини), като се използват тънкопластови сплайн процедури в R (2) придружено от обобщено адитивно моделиране за тестване на основните и интерактивни ефекти на трите макронутриента. Тези методи са описани другаде (22, 34, 35).

За да се изследва връзката между фенестрациите, диетичните макронутриенти и корелациите на чревния микробиом бяха извършени с помощта на теста на Spearman в SigmaPlot (SPSS версия 12.5). За по-нататъшно изследване на тези взаимоотношения след това тествахме дали изобилието от циркулиращи метаболити (мастни киселини и аминокиселини) и бактериални висши таксони корелира с фенестрационната морфология, използвайки теоретичен информационен подход за усредняване на модела с линейни модели (LM) (3). Оценихме дали диетичните корелати засягат три аспекта на фенестрациите: 1) процент порьозност [преобразуван в пропорция и logit трансформиран за нормализиране (40)], 2) диаметър на фенестрацията и 3) честота на фенестрация [+0,5 и дневник, трансформиран за нормализиране (42)]. LM бяха монтирани с помощта на функцията “lm” в база пакет от R (29), а усредняването на модела беше извършено с помощта на пакета MuMIn (1).

Геометричен рамков анализ на връзката между макронутриенти и LSEC фенестрации.

диетични

Фиг. 1.Анализ на геометричната рамка, показващ връзката между макронутриентите и фенестрационната порьозност (A) и диаметър (Б.). Във всяка повърхност синьото представлява най-ниската стойност, докато червеното представлява най-високата стойност. Всяка графика представлява разрез през средната стойност на третия макронутриент (стойността, предоставена в скоби под х-етикет на оста). Представени са три графики, показващи взаимодействието между протеини и въглехидрати, протеини и мазнини и въглехидрати и мазнини. Областите с порьозност или диаметър с най-голям диаметър на фенестрация са обградени в червено, докато тези с най-нисък диаметър са обградени в синьо. Мазнините имаха значителен ефект върху порьозността (P = 0,016), докато протеините и въглехидратите имат значително влияние върху диаметъра (P = 0,028 и P = 0,006, съответно).


Фиг. 2.Сканиране на електронни микрофотографии на луминалната повърхност на синусоидалните ендотелни клетки на черния дроб. Някои фенестрации са обозначени със стрелка. A: увеличен диаметър на фенестрация, предизвикан от диети с ниско съдържание на въглехидрати или протеини. Б.: диаметърът на фенестрацията е намален при диети с високо съдържание на въглехидрати или протеини. ° С: повишена порьозност, предизвикана от прием на мазнини от ∼20 kJ · мишка -1 ден · -1 . д: диети с високо съдържание на мазнини водят до намалена ендотелна порьозност чрез загуба на фенестрации (първоначално увеличение: × 15 000).

Таблица 1. GAM за фиг. 1

Фиг. 1A: R кв. (прил.) = 0,0942. Обяснено отклонение = 11,7%. REML = 234,77. Прогнозен мащаб = 2.1008; н = 129. Фиг. 1Б.: R кв. (прил.) = 0,052. Обяснено отклонение = 6,42%. REML = 272.02. Прогнозна скала = 3.8373; н = 129. GAMs, обобщено адитивно моделиране; edf, приблизителни степени на свобода; REM, ограничена максимална вероятност.

* P ** P

Фиг. 3.Връзката между фенестрациите (диаметър, порьозност) и чревната микробиома (Firmicutes, Bacteroidetes). Налице е значителна положителна връзка между фенестрационната порьозност и диаметъра с Фиксира изобилие (A и Б.: Корелация на Спиърманс, r = 0,224, P = 0,046 и r = 0,313, P = 0,0057, съответно). Имаше значителна отрицателна връзка между диаметъра на фенестрацията и Бактероидети изобилие (д: r = -0,227, P = 0,045) и незначителна отрицателна тенденция с фенестрационна порьозност и Бактероидети (° С: r = -0,186, P = 0,087).

Моделно осредняване на по-ниски таксономични подреждания показва, че нито едно бактериално семейство не е особено добро предсказване на диаметър или порьозност на фенестрацията (всички семейства имат относително значение

Фиг. 4.Връзката между фенилаланин (A) и мастните киселини C16: 0 (Б.), C20: 4 (° С) и C19: 0 (д). Имаше значителна корелация между порьозността и циркулиращия фенилаланин (P = 0,037, r = 0,215), C16: 0 (P = 0,027, r = -0,227) и C20: 4 (P = 0,037, r = −0,216) и между диаметъра на фенестрацията и C19: 0 (P = 0,020, r = -0,238).

Няма значителни връзки между фенестрационната порьозност, диаметър или честота с нивата на циркулиране на общите аминокиселини, общите аминокиселини с разклонена верига или някоя от отделните аминокиселини с изключение на фенилаланин, който има отрицателна връзка с порьозносттаP = 0,037, н = 94 мишки; Фиг. 4A) и аспарагинова киселина, която има отрицателна връзка с диаметъра (P = 0,047). Моделното осредняване на по-сложни модели също показва, че концентрацията на циркулиращите аминокиселини не е добър предиктор за диаметъра или честотата на фенестрация; и в двата случая най-добрите набори от модели съдържаха нулевите модели. Най-добрият предиктор е изобилието от хидроксилни и сярни селенови аминокиселини, които имат относително значение 0,832 за реакцията на диаметъра на фенестрацията и се оценява като положителен ефект, но с много лоша прецизност [LM Est. (LCI до UCI) = 11,779 (-1,075 до 24,633)]. За фенестрационната порьозност изобилието от алифатни аминокиселини имаше относително значение 1, което се появява във всички модели в горния набор от модели. Средните оценки на модела показват, че увеличаването на алифатните аминокиселини е свързано с намаление на ендотелната порьозност [LM Est. (LCI до UCI) = -0,431 (-0,799 до 0,063)].

Установено е, че редица хранителни интервенции влияят върху стареенето и продължителността на живота, като най-широко проучваната е калоричната рестрикция. По-рано показахме, че ограничаването на калориите е свързано с повишени фенестрации в напреднала възраст (16). Резултатите от настоящото ни проучване предполагат, че това може да е вторично за намаляването на всеки от макроелементите, действащи по различни механизми: намаляването на приема на мазнини, което води до увеличен диаметър на фенестрацията, намаляването на приема на протеини и въглехидрати, което води до повишена честота на фенестрация. От друга страна, нашите проучвания върху насекоми (24) и мишки (34) показват, че диетите с ниско съдържание на протеини и високо съдържание на въглехидрати са свързани с по-дълъг живот и подобрено здраве в късния живот. Не открихме никакво пряко благотворно въздействие на диети с ниско съдържание на протеини и високо съдържание на въглехидрати върху фенестрациите, може би като последица от противоположните ефекти на ниско съдържание на протеини и високо съдържание на въглехидрати върху диаметъра на фенестрацията.

В нашето проучване на Geometric Framework за ефектите на макронутриентите върху стареенето установихме, че аминокиселините с разклонена верига посредничат някои от предимствата на диетата с ниско съдържание на протеини и високо въглехидрати върху свързаното с възрастта здраве и продължителност на живота (34). Тук не открихме никаква връзка между аминокиселините с разклонена верига и фенестрациите. Изследването на останалите аминокиселини разкри обратна връзка между порьозността и концентрациите на фенилаланин. Въпреки че това може да бъде случайно откритие, трябва да се отбележи, че повишеното ниво на фенилаланин е рисков фактор за хипертриглицеридемия (26), докато дефенестрацията е механизъм за хиперлипидемия чрез нарушено чернодробно усвояване на остатъци от хиломикрон (15).

В заключение, приемът на макронутриенти имаше сложни ефекти върху фенестрациите на LSEC. Като цяло, намаленият прием на макроелементи е свързан с повишени мерки за честота на фенестрация и/или диаметър, като мазнините имат доминиращо влияние върху порьозността, медиирани от ефекта им върху честотата на фенестрациите. Има връзка между промените в микробиома, предизвикани от диетата (Firmicutes, Bacteroidetes), индуцирани от диетата промени в свободните мастни киселини и фенестрации, които биха могли да осигурят механизми, свързващи диетата с промените в LSEC ултраструктурата.