Резюме
Заден план
Млечните фосфолипиди (PLs) намаляват нивата на липидите в черния дроб, когато се дават като хранителна добавка на мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини. Предполагаме, че това може да се дължи на намален прием на холестерол в червата.
Методи
На мишките се дава диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 3 или 5 седмици, в която няма добавен PL или които са допълнени с 1,2% от теглото PL от краве мляко. Бяха изследвани два млечни PL препарата: а) богат на PL млечен млечен екстракт (PLRDME) и б) предлаган в търговската мрежа млечен PL концентрат (PC-700). Поглъщането на холестерол в червата се оценява чрез измерване на фекалната и чернодробната радиоактивност след интрагастрално приложение на [14 С] холестерол и [3 Н] ситостанол. Фекалните и чернодробните липиди се измерват ензимно и чрез ESI-MS/MS.
Резултати
И двата препарата PL водят до значително намаляване на общия чернодробен холестерол и триглицеридите (-20% до -60%, P 14 C] холестерол е значително по-малко (-30% до -60%, P 14 С] холестерол и немаркиран холестерол е значително по-висок при PL-добавени мишки (+ 15% до + 30%, P 14 С] холестерол (P 14 С] холестерол (P
Заден план
Доказано е, че диетичните фосфолипиди (PLs) намаляват плазмените и чернодробните липидни нива при експериментални животни [1], което предполага, че те могат да имат терапевтична стойност при пациенти с хиперлипидемия и/или мастна чернодробна болест. Следователно нашата лаборатория изследва липидопонижаващите свойства на PL от различни източници [2–4] и ние показахме, че богат на PL млечен млечен екстракт (PLRDME), съдържащ предимно фосфатидилхолин (PC), сфингомиелин (SM) и фосфатидилетаноламин (PE), значително понижава плазмените и чернодробните липидни нива при мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини. Добавянето на 2,5% тегловни (тегловни) млечен екстракт от PL към диета, съдържаща 21% маслена мазнина и 0,15% холестерол, доведе до по-ниски нива на серумен холестерол (-23%) и значително намалени нива на чернодробни триглицериди (-44%) и чернодробен холестерол (-48%) [2].
Гореспоменатите резултати ни накараха да предположим, че екстрактите на PL от млякото (съдържащи няколко вида PL с предимно наситени мастни киселини) могат да имат терапевтична стойност при хората. Способността на млечните екстракти PL да повлияват метаболизма на чревните мазнини при експериментални животни, хранени с обезогенна/атерогенна диета обаче не е проучена и степента, до която техните чревни ефекти са свързани с понижаване на чернодробните липиди, не е оценена. Следователно целта на настоящото проучване беше да се определи: а) дали диетичните млечни екстракти от PL, съдържащи различни видове PL, са в състояние да инхибират абсорбцията на чревния холестерол при мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, и б) степента, до която тези млечни PL влияят в червата са свързани с мощната им способност да намаляват нивата на холестерола и триглицеридите в черния дроб.
Методи
Животни и диети
Оценка на абсорбцията на холестерол в червата
Анализ на фосфолипиди и церамиди чрез ESI-MS/MS
Статистически анализ
Стойностите в текста и таблиците са средни стойности ± SEM. Prism 4 за Macintosh (версия 4.0c, GraphPad Software, Inc.) е използван за статистически анализи. Значителни разлики между HF и HFPL групите бяха оценени от Student's т-тест. Коефициентите на корелация на Pearson (r) бяха определени за оценка на връзката между параметрите. Вероятност от P
Резултати
Метаболитни ефекти на добавката PLRDME
Параметрите на метаболизма се оценяват след 3 или 5 седмици при мишки, хранени само с HF диета, и при тези, на които е дадена HF диета, допълнена с PLRDME (Таблица 1). Три мишки трябваше да бъдат изключени, защото или те не са оцелели след сондата, или не са били метаболитно стабилни след процедурата. Добавянето на PLRDME към високочестотната диета нямаше значителен ефект върху приема на храна, наддаването на тегло или екскрецията на фекалиите. Чернодробното тегло има тенденция да бъде по-ниско в HFPL спрямо HF след 3 седмици (11%, P = 0,095). Това беше по-малко очевидно след 5 седмици (5%, P = 0,37). Съотношенията на теглото на черния дроб към тялото обаче са значително по-ниски при HFPL спрямо HF след 3 седмици (12%, P = 0,02) и има тенденция да бъде по-ниска след 5 седмици (9%, P = 0,06) (Таблица 1).
Метаболитни ефекти на добавката PC-700
За да се потвърди ефектът на млечния PL върху чревния холестерол и усвояването на растителен стерол, беше изследван втори препарат за млечен PL (т.е. PC-700). Този търговски наличен млечен концентрат PL съдържа повече обща мазнина (85% спрямо 57% тегловни) и повече PL (60% срещу 48% тегловни) от PLRDME. Следователно по-малко PC-700 беше добавено към HF диетата, за да се гарантира, че диетите HFPL съдържат сравними количества мляко PL (т.е. 1,2% тегловни). PC-700 и PLRDME имаха подобен състав на PL (включващ предимно PC, PE и SM) и подобен състав на мастни киселини (включващ предимно палмитинова, стеаринова и олеинова киселини).
Мишките бяха хранени с HF диета и HF диета, съдържаща PC-700 (обозначена като HFPC-700 група). Те са изследвани по същия начин, както при първия експеримент. Метаболитните параметри за тези животни са дадени в таблица 3. Две мишки трябваше да бъдат изключени от анализа, тъй като те не реагираха добре на интрагастралния сондаж. Добавянето на РС-700 към високочестотната диета нямаше значителен ефект върху нито един от параметрите. Тенденцията на PLRDME да намалява теглото на черния дроб не е очевидна при мишки, допълнени с PC-700.
Общите нива на липидите, холестерола и триглицеридите са по-ниски в черния дроб на HFPC-700 спрямо HF мишки (съответно -22%, -45% и -35%) след 3 седмици на диета, въпреки че това достига статистическа значимост само за холестерола в черния дроб ( Таблица 4). Както в първия експеримент с PLRDME, понижаващият липидите ефект на PC-700 е по-изразен след 5 седмици хранене (т.е. съответно -45%, -57% и -63%). Чернодробното натрупване на интрагастрално администриран [14 C] холестерол също е значително по-ниско при HFPC-700 спрямо HF мишки (-60% и -65% съответно на 3 и 5 седмици). Чревната абсорбция на [3 H] ситостанол отново се доказва от наличието на интрагастрично администриран [3 H] ситостанол в черния дроб. Той е по-нисък при HFPC-700 срещу HF мишки, достигайки статистическа значимост, когато се комбинират 3-и 5-седмични данни (както е показано вдясно в Таблица 4). Комбинираните данни показват, че добавянето на PC-700 е свързано с приблизително 30% до 65% намаляване на чернодробните липидни параметри, което е сходно по големина с това, получено с PLRDME. Трябва да се отбележи обаче, че експериментите с PLRDME и PC-700 не са провеждани едновременно и поради това беше трудно директно да се сравни ефикасността на двата PL препарати.
Общата екскреция на липиди с фекалии и холестерол за разлика е увеличена при HFPC-700 спрямо HF животни. Не се наблюдават значителни разлики в екскрецията на триглицериди с фекалии, въпреки че комбинираните данни предполагат увеличение. Екскрецията на интрагастрално администриран [14 C] холестерол също се увеличава при HFPC-700 мишки. За разлика от резултатите от първия експеримент, екскрецията на интрагастрално администриран [3Н] ситостанол не е значително по-висока при HF мишки, допълнени с РС-700. Така изчисленият процент абсорбция на холестерол е по-нисък при HFPL спрямо HF мишки: 36,7 ± 2,0% срещу 44,5 ± 2,4% за 3 седмици (P = 0,03) и 37,9 ± 2,0% срещу 52,1 ± 3,1% за 5 седмици (P = 0,001). Валидността на това изчисление обаче трябва да бъде поставена под съмнение с оглед на очевидното поглъщане на [3 H] ситостанол в червата (както е отбелязано в първия експеримент). Комбинираните данни показват, че добавянето на PC-700 води до значително увеличение на фекалната екскреция на общия липид, немаркиран холестерол и радиоактивно белязан интрагастрично администриран холестерол (Таблица 4).
Нива на липидите в черния дроб и усвояването на холестерола в червата
Извършен е линеен регресионен анализ, за да се определи дали има някаква връзка между нивата на липидите в черния дроб и разпределението на интрагастрално администриран [14 С] холестерол между черния дроб и изпражненията на диетични животни. Резултатите за мишки, допълнени с PLRDME, са показани на фигура 1А, а тези за мишки, допълнени с PC-700, са показани на фигура 1В. И в двата случая е установена силна положителна корелация между нивата на чернодробния холестерол и триглицеридите и чернодробното натрупване на интрагастрично приложен [14 С] холестерол. В същото време е установена отрицателна корелация между нивата на чернодробния холестерол и триглицеридите и фекалната екскреция на интрагастрично приложен [14 С] холестерол.
Връзка между чернодробните липиди и интрагастрично прилаганите [ 14. C] холестерол в черния дроб и изпражненията на мишки, хранени само с диета с високо съдържание на мазнини или диета с високо съдържание на мазнини, допълнена с млечни фосфолипиди: (A) PLRDME или (B) PC-700. Данните представляват отделни животни след 3 или 5 седмици диетично хранене. Отворените кръгове представляват мишки с високо съдържание на мазнини (HF); запълнените кръгове представляват животни, допълнени с млечен фосфолипид (HFPL или HFPC-700). Коефициент на корелация (r 2) е показан във всеки панел заедно с нивото на статистическа значимост.
Допълнителен анализ на фекалните липиди при мишки, допълнени с PLRDME
Анализ на чернодробни фосфолипиди при мишки, допълнени с PLRDME
С оглед на по-високите нива на PL в диетата и във изпражненията на HFPL мишки, ние поставихме под въпрос дали този PL е свързан с променени нива на чернодробен PL (т.е., съпътстващ наблюдаваните намаления на чернодробните триглицериди и холестерола). PL се измерва директно в дублирани проби от цяла диета и приемът на отделни видове PL се изчислява за мишки в 8-седмичното проучване (т.е. третият експеримент) по отношение на nmol PL, консумиран на мишка на ден. Видовете PL са измерени в черния дроб на мишки, жертвани след 8 седмици на диета. Всички видове PL (с изключение на лизофосфолипид) са били увеличени около 40 пъти при диетата с HFPL. Нивата на PL в черния дроб обаче не се повишават и всъщност са склонни да бъдат по-ниски при HFPL срещу HF мишки. Чернодробният PC (основните видове PL в черния дроб) е значително по-малък при HFPL спрямо HF черен дроб (-21%, P Таблица 6 Нива на фосфолипиди и церамиди в храната и черния дроб на мишки, хранени само с високомаслена диета (HF) или диета с високо съдържание на мазнини, допълнена с млечни фосфолипиди под формата на богат на фосфолипиди млечен млечен екстракт (PLRDME)
Дискусия
Настоящите данни подкрепят предишната ни работа, показваща, че добавянето на 1,2% тегловни PLs към диетата намалява нивата на чернодробния холестерол и триглицеридите при мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини [2]. Намалените нива на липидите в черния дроб на PL-допълнени мишки са свързани с намаляване на чернодробното натрупване на интрагастрично администриран [14 C] холестерол и увеличаване на фекалната екскреция на холестерол. Тези резултати предполагат, че един от механизмите, при които екстрактите от PL мляко благоприятно намаляват повишените нива на чернодробни липиди при мишки, хранени с обезогенна и/или атерогенна диета, е чрез намаляване на усвояването на холестерола в червата.
Предишни проучвания са предоставили доказателства, че хранителните PLs имат способността да намаляват абсорбцията на холестерол в червата [5]. Поради това ние се заехме да изчислим процентното усвояване на холестерола в настоящото проучване, използвайки фекален метод с двоен изотоп, който е валидиран и широко използван при мишки [9]. Този индиректен метод за изчисляване на процентното усвояване на холестерол разчита на предположението, че интрагастрално администриран [3Н] ситостанол не се абсорбира. Неочаквано това не беше така в настоящите експерименти, както се доказва от наличието на [3Н] ситостанол в черния дроб на мишки, хранени с диета. Следователно изчислените проценти на абсорбирания холестерол в настоящото проучване са ненадеждни и те трябва да се тълкуват с повишено внимание.
Обикновено се смята, че повишеният поток на холестерол от червата към черния дроб, поради повишения диетичен холестерол, води до повишено производство на оксистероли в черния дроб и активиране на LXR-SREBP-1c пътя [20, 21]. Синтезът на мастни киселини се засилва, насърчавайки производството на чернодробни триглицериди и развитието на чернодробна стеатоза. Следователно намаленото усвояване на холестерол в червата има тенденция да има обратен ефект и това е вероятно обяснение за способността на диетичните млечни PLs да намаляват нивата на чернодробните триглицериди. Подкрепа за този сценарий идва от проучвания с инхибитора на абсорбцията на холестерол езетимиб, за който е доказано, че намалява чернодробната LXR активност и намалява чернодробната стеатоза [22]. В предишни експерименти установихме, че добавката PLRDME причинява значително намаляване на LXR-регулираните гени, както и експресията на ензими, засягащи синтеза на мастни киселини (напр. Синтаза на мастни киселини и ацетил-CoA карбоксилаза) [2]. Въпреки това е необходима допълнителна работа, включваща директно измерване на чернодробния синтез на TG, за да се обоснове връзката между намалената абсорбция на холестерол и намалените нива на чернодробен TG при PL-допълнени мишки.
Настоящите резултати показват, че екстрактите от мляко PL могат да имат терапевтична полза при лица с мастна чернодробна болест или такива с хиперлипидемия. Степента, до която хранителните PLs могат да повлияят на плазмените и чернодробните нива на липидите, остава да бъде определена. Проучванията при хора [28–30], проведени при малък брой индивиди, подкрепят концепцията, че луминисният или диетичният лецитин (т.е. PC) може да намали абсорбцията на холестерол в червата при човека. В едно от тези проучвания на хора се влива интрадуоденално с относително голямо количество лецитин (150 mg/kg/h), което не само блокира усвояването на холестерола, но всъщност „извлича“ холестерола от чревната лигавица, отразено от „отрицателна“ абсорбция стойности [28]. Във второ проучване 10 пациенти с хипертриглицеридемия са лекувани с лецитин (10 g/ден) и след 2-3 седмици абсорбцията на холестерола е намалена от 42 ± 2% на 36 ± 2% (P
Заключения
Настоящите експерименти показват, че екстрактите от PL мляко имат благоприятно въздействие върху метаболизма на черния дроб и чревния холестерол при мишки, хранени с обезогенна и/или атерогенна диета. По-конкретно, настоящата работа предоставя доказателства, че екстрактите от млечен PL имат потенциал да намалят усвояването на холестерола в червата. Дали това е от терапевтично значение за човека или не, предстои да се определи.