• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: може би@uiuc.edu

Принос от May R. Berenbaum, 22 януари 2008 г. (получено за преглед на 19 декември 2007 г.)

диоксид

Тази статия има поправка. Моля виж:

Резюме

При настоящите нива на антропогенни емисии се очаква атмосферната концентрация на въглероден диоксид (CO2) от 381 μmol mol -1 да се повиши до 550 μmol mol -1 до 2050 г. (1). Увеличението на CO2 се очаква да увеличи производителността на агроекосистемите чрез подобряване на фотосинтезата и ефективността на използване на водата, особено в култури С3 (2), въпреки че точните оценки на степента на подобрението варират в зависимост от експерименталния подход (3). Такива прогнози обаче обикновено не отчитат потенциала за взаимодействия между растенията и тревопасните насекоми за промяна на ефекта на оплождане на повишен CO2 върху растителната продукция (4). Влиянието на тревопасната растителност върху реакциите на растенията към повишен CO2 обаче може лесно да бъде измерено чрез експерименти за обогатяване на концентрация на свободен въздух (FACE), при които движението на насекоми в полеви участъци е неограничено.

Обикновено повишеният CO2 намалява качеството на растението-гостоприемник, като увеличава съотношението C: N, специфичната маса и дебелина на листата, дела на неструктурните въглехидрати и разпределението във фенолни съединения (5 ⇓ –7). Въпреки това, други съединения, като протеиназни инхибитори (PI), могат да играят роля в защитата на растенията, като влияят върху смилаемостта на протеините и намаляват наличието на свободни аминокиселини, необходими на насекомите за растеж, развитие и размножаване (8). Цистеиновите протеинази са често срещани в слабо киселинното средно черво (рН 5-7) на много колеоптерани (9, 10), а цистеиновите PI (CystPIs) в растителните тъкани намаляват растежа и развитието чрез инхибиране на тези протеинази (10, 11). Индукцията на сигналния път на язмоната в растенията от увреждане на тревопасни животни води до повишен синтез на CystPI (12).

Соята (Glycine max), най-широко отглежданото бобово растение в света, има един конститутивен ген CystPI (L1) и два индуцируеми гена CystPI (N2 и R1) (13, 14). Соевите CystPI, както и синтетичният CystPI, трансепоксисукцини-1-левцил-амидо (4-гуанидино) бутан (E-64), инхибират активността, растежа и оцеляването на личинките и възрастните западна царевица на цистеин в червата коренов червей (WCR; Diabrotica virgifera virgifera LeConte: Coleoptera) (10, 13, 15, 16). Въпреки че WCR обикновено причинява икономическа вреда, като уврежда корените на царевицата (Zea mays), вариант на WCR се храни със соеви листа и снася яйца в соевите полета (17). Японският бръмбар (JB; Popillia japonica Newman: Coleoptera), широко полифагичен вид, въведен в Съединените щати през 1916 г. и сега разширяващ обхвата си в Средния Запад, се храни с ≈300 вида диви и култивирани растения в 79 семейства; соята е сред многото растения гостоприемници (18). Повишеният CO2 увеличава растителността и яйцекласността както от JB, така и от WCR при соя, отглеждана при експерименти с FACE (19 ⇓ –21). Въпреки че захарите могат да стимулират храненето в JB (18), по-високите нива на въглехидрати в листата не отчитат промените в предпочитанията или плодовитостта на този вид (21), оставяйки отворена възможността растителните химически защити, като CystPIs, да медиират тези промени.

За да се изследва ролята на цистеиновите протеинази в променената резистентност към колеоптерано-тревопасни животни, соята се отглежда в обекта SoyFACE, създаден в Университета на Илинойс в Урбана-Шампейн. Съоръжението SoyFACE, което повишава CO2 при изцяло открити полеви условия без никакви бариери, ни позволи да проучим механизма, при който повишеният CO2 увеличава чувствителността на соята към естествени тревопасни животни. По-конкретно, ние изследвахме дали растежът на повишен CO2 намалява надолу-регулира експресията на гени, свързани със сигнални хормони, които регулират CystPI и други защитни гени, дали активността на CystPI в листата на соята е намалена при повишени CO2 и дали JB и WCR показват по-високи нива на храносмилането цистеин протеиназна активност в червата им при консумация на соеви листа, отглеждани при повишен CO2. Намаляването на способността за мобилизиране на защитни сили в отговор на тревопасните растения е потенциален механизъм за отчитане на засиленото представяне на бръмбарите, консумиращи листа от соя, отглеждана при повишен CO2 и за увеличеното количество щети, нанесени от соевите растения при повишени CO2 при полеви условия.

Резултати

За да се определи ефектът на повишения CO2 върху експресията на соевите защитни гени, пет гена от напълно разширени листа, отглеждани или под околна среда или при повишен CO2, бяха анализирани чрез полуколичествена RT-PCR. Анализирахме експресията на 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат синтаза (acc), която е ключовата регулаторна точка в биосинтеза на сигналния хормон етилен, два гена, свързани със сигналния хормон язмонова киселина (JA), липоксигеназа 7 (lox7) и 8 (lox8), и гена, кодиращ вегетативна липоксигеназа 6 (lox6), който не е свързан с растителната сигнализация и служи като вътрешен контрол (22 ⇓ –24).

Няма основен ефект на повишен CO2 върху експресията на ac (P = 0.92). Значителното взаимодействие между повишения CO2 и тревопасната растителност от JB (P ≤ 0,01) показва, че индуцирането на ac след растителността е намалено в листата, отглеждани при повишени CO2, в сравнение с околния CO2 (фиг. 1). Един ден след увреждане от JB, acc е индуциран с 86% в листата, отглеждани в атмосферния CO2, но тази индукция е била само 54% ​​в листата, отглеждани в повишен CO2. Индукцията на acc се увеличава до 222% в околните листа 3 дни след атаката, но само до 155% след 3 дни в листата, отглеждани в повишен CO2. Подобни резултати бяха намерени в отговор на щети, нанесени от WCR (данните не са показани).

Експресионен анализ на гени, свързани с JA и биосинтеза на етилен. Количествена RT-PCR на пет гена от напълно разширени листа от соя, отглеждани или при повишен [CO2] (CO2), или при околна среда [CO2] (A): 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат синтаза (съотв.), Липоксигеназа 7 (lox7), 8 (lox8) и 6 (lox6). РНК се извлича от четири повторения (по един повтор на участък) или от ненападнати (C), или от нападнати листа от японски бръмбари (B) за 1 или 3 дни и се транскрибира обратно в cDNA. PCR реакциите се репликират от четири независими cDNA проби за всички праймери. Преди статистическия анализ, стойностите на интензитета на точката, генерирани от софтуера за анализ на изображения за всеки ген, бяха нормализирани спрямо интензитета на актина, за да се коригират разликите в амплификацията на cDNA. Фигурата е съставна част от множество експерименти и съдържа изображения, слепени на място.

Повишените CO2 инхибират съставните нива на lox7 и lox8 съответно с 30% и 28% (P ≤ 0,01). Както при Acc, степента на индукция след атака на бръмбари е по-ниска за растения, отглеждани при повишен CO2 от околната среда (фиг. 1). Средно по двете времеви точки, експресията на lox7 след растителност се увеличава при атмосферния CO2 с 98%, но само със 77% при повишения CO2. По същия начин, експресията на lox8 след тревопасните растения се е увеличила с 49% при атмосферния CO2, но само с 5% при повишения CO2. Нивото на експресия и на двата гена след индукция от тревопасни растения се увеличава с времето (P ≤ 0,01). Както се очаква, няма промени в експресията на lox6 от повишени CO2 или повреди от бръмбари (P = 0,5) (Фиг. 1).

Нашите резултати показват, че повишеният CO2 не само намалява експресията на гени, свързани със сигналните хормони JA и етилен, но и намалява тяхната индукция след увреждане на бръмбарите. Положителното взаимодействие между JA и етилен след раняване синергично индуцира PI гени, като CystPI гени в соята (14). Промените в синтеза на JA чрез повишен CO2 могат да повлияят на конститутивни и индуцируеми нива на активност на CystPI.

Язмоновата киселина (JA), повсеместен хормон на раната, за който е известно, че увеличава синтеза на различни метаболити, свързани с отбраната, е силно замесена в активирането на синтеза на CystPI (12). Ендогенните нива на JA нарастват (5–500 ng на растение), пропорционално на размера на увреждането, в рамките на 90 минути (25, 26). Добавянето на JA и неговия метилов естер, метил жасмонат (MeJA), към листата имитира увреждане на листата чрез увеличаване на синтеза на CystPI (12).

CystPI могат да повлияят на поведението и работата на възрастните колеоптерани. CystPI E-64 в диетата на възрастни женски WCR намалява броя на снесените яйца в резултат на комбинация от директното инхибиране на храносмилането и отрицателната обратна връзка, което намалява приема на храна и насекомата (10). За да определим последиците от промените в активността на соята CystPI в естествено срещащи се растителноядни животни, ние оценихме общата и цистеин протеиназната активност в червата на JB и WCR, които се хранят с растения, отглеждани при околна среда или повишен CO2. Активността на цистеин протеиназата се увеличава с 50% (P = 0,03) в JB и 37% (P = 0,01) в WCR, а общата протеиназна активност се увеличава с 41% (P = 0,006) в JB и 41% (P = 0,01) в WCR, които се хранят върху листата, развити под повишен в сравнение с околния CO2 (фиг. 4). Нашите резултати показват, че промените в активността на CystPI, произведени в растения, отглеждани при повишен CO2, повишават храносмилателната активност на протеиназата в червата на тревопасните животни, като подобряват смилаемостта на листата за възрастни JB и WCR и подобряват тяхната ефективност (19 ⇓ –21).

Обща активност на протеиназа и цистеин протеиназа в червата на бръмбарите. (A и B) JB (A) или WCR (B), хранени в продължение на 3 дни върху соеви листа, отглеждани при околна среда или повишен CO2. Стойностите представляват средната стойност на четири независими извадки (един репликат на FACE графика). Азоказеинолитичните и цистеин протеиназните дейности са представени в различни единици. Звездичките показват нивото на значителни разлики между околната среда и обработките с повишен CO2 (*, P -1 и един участък е фумигиран до целеви CO2 от 550 μmol mol -1. Експерименталните участъци са разделени на поне 100 m, за да се предотврати кръстосано замърсяване на CO2. Скоростта и положението на отделянето на газ се променят автоматично и непрекъснато със скоростта и посоката на вятъра, за да се поддържа желаното обогатяване в рамките на парцела. Едноминутен среден CO2 е ± 20% от целта за> 95% от времето. текущите темпове на антропогенни емисии, целите за CO2 представляват прогнозирани атмосферни нива през 2050 г. (1).

Във всеки участък от FACE, 38 дни след поникването, бяха избрани 38 неповредени соеви растения на вегетативния етап и най-горният напълно разширен трилистен лист на всяко от осемте растения беше третиран със 150 μg MeJA (Sigma – Aldrich) в 20 μl ланолин паста. Допълнителни 10 растения бяха заразени с пет възрастни JB; 10 растения бяха заразени с пет възрастни WCR и 10 растения служеха като контроли. Половината от обработените и контролни листа бяха събрани за анализ 1 ден след заразяването, а другата половина бяха събрани 3 дни след заразяването. За да се гарантира, че контролните листа остават невредими и че насекомите остават там, където са били поставени, листата са затворени в 1 × 4 mm пластмасова мрежа. Възрастни JB и WCR са събрани от мястото на SoyFACE от растения извън пръстените 24 часа преди заразяването.

След 3 дни хранене с листа, отглеждани при околна среда или повишен CO2, JB и WCR бяха отстранени за анализ на общата активност на чревната протеиназа и активността на цистеин протеиназата. За всеки вид средните черва бяха отстранени от петте бръмбари на всеки лист и комбинирани с средните черва от бръмбарите на петте репликирани листа, за да се създаде една съставна проба за всеки FACE парцел. Средните черва се съхраняват при -20 ° C.

Ефектът на синтетичен инхибитор на цистеин върху активността на чревната протеиназа беше изследван в отделен експеримент. JB и WCR са хранени с изкуствена диета от казеин и пшеничен зародиш, модифицирана от реф. 40 със или без синтетичния цистеинов инхибитор Е-64 (50 nmol). Група от 15 JB или WCR е хранена с контролната диета или изкуствената диета с E-64. Средните черва бяха отстранени, комбинирани, за да образуват съставна проба за всеки вид и обработка, и съхранявани при -20 ° C. Експериментът се повтаря три пъти, за да се генерират три съставни проби, съответно за контролната и лечебната диета.

Съставните проби от средни черва на бръмбари от всеки полеви участък или от експеримента с изкуствена диета се пулверизират в течен азот с хоросан и пестик. Протеиназите от средните черва се екстрахират чрез хомогенизиране на тъкан с 30 mM Tri-K цитрат (рН 6.0) 1: 1 и се инкубират върху лед в продължение на 30 минути. Суспензията се центрофугира при 12 000 × g в продължение на 15 минути при 4 ° C и получената супернатанта се използва като източник на JB или WCR чревна протеиназна активност.

Използвахме азоказеин като субстрат за оценка на общата протеазна активност. Накратко, 10 μl 2 × разреден ензим [чревна протеиназа в 30 mM Tri-K цитрат и 125 μM дитиоеритреитол (pH 6,0)] се добавят към 180 μl 1% азоказеин [в 30 mM Tri-K цитрат (pH 6,0)] и се инкубира при 37 ° С в продължение на 2,5 часа. Реакцията се прекратява чрез добавяне на 300 μl 10% трихлороцетна киселина. След центрофугиране при 10 000 х g за 10 минути, към супернатанта се добавя равен обем от 1 М NaOH и абсорбцията се измерва при 450 nm както в пробите, така и в контролите. Една протеазна единица се определя като количеството ензим, което увеличава абсорбцията с 1 OD/min.

Активността на цистеин протеиназата е оценена чрез използване на хромогенен субстрат p-Glu-Phe-Leu-pNA (36). След това 10 μl от 18 × разредения ензим се добавя към 20 μl от 0,38 mM p-Glu-Phe-Leu-pNA [в 0,1 M NaPhosphate, 0,3 M KCl, 0,1 mM EDTA и 3 mM дитиоеритретол (pH 6,0)] и инкубира се при 37 ° С. Абсорбцията при 410 nm от гнезда на микротитърната плака се измерва на интервали от 20 s за 20 минути с ензими JB и за> 30 минути с ензими WRC. Първоначалните скорости на хидролиза се изчисляват от наклоните на получената графика на абсорбция спрямо времето. Анализите бяха линейни за периода на анализа. Една единица на цистеинова активност беше определена като количеството ензим, необходимо за производството на 1 mM 4-нитроанилин в минута при 37 ° C, използвайки p-Glu-Phe-Leu-pNA като субстрат при дадени условия на анализ.

Данните бяха анализирани със Stat View, версия 5.0 (SAS Institute). Стойностите на интензивността на петна от полуколичествените стойности на активността RT-PCR и CystPI бяха анализирани с 2 × 2 (време × лечение) повторни измервания ANOVA, последвани от защитени LSD на Fisher post hoc сравнения във всички експерименти. Стойностите на активността на цистеин протеиназа бяха анализирани от ANOVA, последвано от защитени LSD на Fisher post hoc сравнения във всички експерименти.

Благодарности

Благодарим на F. Xu и D. Bilgin за техническа помощ в лабораторията, B. O'Neill и T. Mies за помощ при полеви експерименти и Richard Lindroth и Gary Felton за внимателен и конструктивен преглед на ръкописа. Тази работа беше подкрепена от Службата на науката (Биологични и екологични изследвания) и Министерството на енергетиката на САЩ DE-FG02-04ER63849.

Бележки под линия

  • ↵ ¶ До кого да бъде адресирана кореспонденцията. Имейл: Maybeuiuc.edu