Роли Концептуализация, куриране на данни, официален анализ, придобиване на финансиране, разследване, методология, софтуер, визуализация, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

серумните

Affiliations Center for Precision Medicine, Department of Internal Medicine, Section of Molecular Medicine, Wake Forest School of Medicine, Medical Center Boulevard, Winston-Salem, North Carolina United States of America, Department of Genetics, Texas Biomedical Research Institute, San Antonio, Texas, Съединени Американски щати

Роли Куриране на данни, формален анализ, софтуер, писане - оригинален проект

Affiliations Center for Precision Medicine, Department of Internal Medicine, Section of Molecular Medicine, Wake Forest School of Medicine, Medical Center Boulevard, Winston-Salem, North Carolina United States of America, Department of Genetics, Texas Biomedical Research Institute, San Antonio, Texas, Съединени Американски щати

Роли Концептуализация, администриране на проекти, ресурси, надзор, писане - преглед и редактиране

Принадлежност Обществото на затлъстяването, Сребърна пролет, Мериленд, Съединени щати

Роли Концептуализация, куриране на данни, методология, софтуер, писане - преглед и редактиране

Институт за диабет и затлъстяване в Южен Тексас и Катедра по човешка генетика, Тексаския университет, Медицинско училище в Рио Гранде, Браунсвил, Тексас, Съединени американски щати

Роли Концептуализация, придобиване на финансиране, методология, администриране на проекти, ресурси, писане - преглед и редактиране

Институт за диабет и затлъстяване в Южен Тексас и Катедра по човешка генетика, Тексаския университет, Медицинско училище в Рио Гранде, Браунсвил, Тексас, Съединени американски щати

Роли Концептуализация, придобиване на финансиране, методология, администриране на проекти, ресурси, надзор, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Affiliations Center for Precision Medicine, Department of Internal Medicine, Section of Molecular Medicine, Wake Forest School of Medicine, Medical Center Boulevard, Winston-Salem, North Carolina United States of America, Department of Genetics, Texas Biomedical Research Institute, San Antonio, Texas, Съединени американски щати, Югозападен национален център за изследване на примати, Тексаски институт за биомедицински изследвания, Сан Антонио, Тексас, Съединени американски щати

Роли Концептуализация, придобиване на финансиране, разследване, методология, администриране на проекти, ресурси, надзор, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Affiliations Center for Precision Medicine, Department of Internal Medicine, Section of Molecular Medicine, Wake Forest School of Medicine, Medical Center Boulevard, Winston-Salem, North Carolina United States of America, Department of Genetics, Texas Biomedical Research Institute, San Antonio, Texas, Съединени американски щати, Югозападен национален център за изследване на примати, Тексаски институт за биомедицински изследвания, Сан Антонио, Тексас, Съединени американски щати

  • Бисваприя Б. Мисра,
  • Sobha R. Puppala,
  • Антъни Г. Комузи,
  • Майкъл С. Махани,
  • Джон Л. ВандеБерг,
  • Майкъл Оливие,
  • Лора А. Кокс

Фигури

Резюме

Тук докладваме за характеризиране на промените в кръвоносния серумен метаболит в HFHC диетични павиани, които са свързани със състоянието на атеросклеротично заболяване. Идентифицирането на биомаркери на базата на метаболити ще засили нашето разбиране за развитието и прогресията на атеросклерозата. Проучванията разкриват значителни промени в човешкия серумен метаболом една минута след сърдечно исхемично събитие [14]. Въпреки това, не са свързани метаболити с атеросклероза, които биха могли да осигурят по-точни биомаркери от настоящите серумни маркери като LDL-C. Анализът на нашата родословна кохорта бабуини предоставя уникална възможност да се разбере наследствеността на тези циркулационни серумни метаболити в контекста на предизвикателството с диетата с HFHC. В допълнение, идентифицирането на отделни метаболити и биомаркери на пътя на атеросклерозата ще помогне за подобряване на диагностиката на атеросклерозата извън настоящата клинична практика.

Материали и методи

Химикали

Ацетонитрил, изопропанол, метанол и пиридин (всички разтворители за HPLC) и метоксиамин хидрохлорид (MeOX), 1% TMCS в N-метил-N-триметилсилил-трифлуороацетамид (MSTFA), 1% TMCS, съдържащ N- (t-бутилдиметил) -N-метилтрифлуороацетамид (MTBSTFA) и адонитол (вътрешен стандарт) са получени от Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, САЩ.

Проби от животни и серум

Уча дизайн

В предварително публикуваното ни проучване [34] 112 павиани от родословната колония на SNPRC са били хранени с диета HFHC в продължение на 2 години. Възрастни и полови млади възрастни бабуини (8–12 години) (Papio hamadryas) са хранени с маймуна чау ad libitum от отбиването до започване на проучването за диетични предизвикателства (диета „Чоу“: 12% енергия от мазнини, 18% от протеини и 69 % от въглехидрати, състоящи се от 0,29% глюкоза и 0,32% фруктоза; „Monkey Diet 25/50456,“ LabDiet, PMI Nutrition International, Сейнт Луис, Мисури), и след това бяха предизвикани в продължение на 2 години с атерогенна диета (40% от калориите като мазнини и 1,7 mg холестерол на kcal), приготвени от смес от свинска мас, холестерол, натриев хлорид, витамини [аскорбинова киселина и витамин А (ретинилацетат)] и вода до основна диета („Monkey Diet 25/50456,“ LabDiet, PMI Nutrition International, Сейнт Луис, Мисури). Приблизителната средна стойност за дневен прием на животно е 400 g (

1200 kcal) за диетата HFHC. Клинични мерки бяха получени от плазмени проби за описаната кохорта бабуини на изходно ниво (диета с чау) и в края на 2-годишното предизвикателство с диетата с HFHC. Те включват телесно тегло, липопротеинови мерки, данни за лезии, маркери за възпаление и оксидативен стрес и артериално съответствие. За това конкретно проучване избрахме подмножество от тези 112 животни (мъжки = 34, женски = 26) въз основа на стойностите за кръвни концентрации на LDL-C, HDL-C, общ холестерол и глюкоза и тежест на атеросклеротичните лезии, извънматочна мазнини за сърцето и телесното тегло като крайна точка за избиране на най-екстремните HFHC диети „реагиращи“ и „неотговарящи“, т.е. за обогатяване на екстремните метаболитни фенотипове и по този начин за повишаване на способността да се различава сигнала (където наблюдавани са големи промени в клиничните мерки) от шума (където не са регистрирани значителни промени в клиничните мерки).

Артериални лезии, свързани със ССЗ биомаркери, липопротеини и други клинични мерки

Образуването на лезии в три основни артерии: аортната дъга, гръдния отдел на низходящата аорта и общата илиачна артерия бяха оценени при бабуини след 2 години предизвикателство с диета HFHC, които бяха хуманно евтаназирани и подложени на стандартни процедури за аутопсия, както е описано [34] . Общите концентрации на серумен холестерол и триглицериди (TG) се определят ензимно, като се използват търговски реагенти в анализатор за клинична химия. HDL-C се измерва в супернатанта след утаяване с хепарин-Mn +2. Кръвната глюкоза се измерва с помощта на инструмента за клинична химия Alfa Wasserman ACE (West Caldwell., NJ). Обобщенията на суровите данни са представени като средства и стандартни отклонения.

Екстракция на серумна проба и дериватизация за GC-MS анализ

Аликвотни части (30 μL) от серумни проби бяха подложени на последователна екстракция с разтворител, веднъж всяка с 1 ml ацетонитрил: изопропанол: вода (3: 3: 2) и 500 μL смеси ацетонитрил: вода (1: 1) при 4 ° C [35]. Адонитол (5 μL от 10 mg/ml запас) се добавя към всяка аликвотна част като вътрешен стандарт преди екстракцията. Събраните екстракти (

1500 μL) от двата етапа се сушат под вакуум при 4 ° С преди химическа дериватизация (реакции на силилиране). Фиктивни екстракции, извършени в заготовки за микроцентрифуги, служеха като заготовки за екстракция, за да се отчетат фоновият шум и други източници на замърсяване. След това пробите от серума бяха последователно дериватизирани с метоксиамин хидрохлорид (MeOX) и 1% TMCS в N-метил-N-триметилсилил-трифлуороацетамид (MSTFA) или 1% TMCS, съдържащи N- (t-бутилдиметилсилил) -N-метилтрифлуороацетамид (MTB) другаде [36–39]. Накратко, етапите включваха добавяне на 10 μL MeOX (20 mg mL -1) в пиридин, инкубиран при разклащане при 55 ° C в продължение на 60 минути, последвано от триметилсилилиране при 60 ° C в продължение на 60 минути след добавяне на 90 μL MSTFA или MTBSTFA [38– 40].

Метаболомен анализ чрез 2D GC-ToF-MS

Обработка на 2D GC-MS данни

2D GC-MS наборите от данни бяха обработени (почистени, подравнени и анотирани) с помощта на ChromaToF версия 4.71.0.0 (LECO Corp., Мичиган, САЩ), както е описано [36, 38, 39] с настройки като S/N: 25; ширина на пика: 0,15, отместване на основната линия: 1; обхват m/z: 40–600, резултатът за съвпадение на библиотеката се отрязва при 600 като първоначално прекъсване). Спектралното съвпадение на библиотеката за идентифициране на съединение се извършва по същество следвайки настройки, както е описано по-рано [38, 39]. Включени са филтрираните сурови GC-MS данни

600 ръчно подготвени метаболити. Основните пикови площи (BPC) на масовите фрагменти (m/z) бяха нормализирани с помощта на средна нормализация, последвана от log2 трансформация. По-нататък пиковите площи се нормализират чрез разделяне на всяка стойност на пиковата площ на площта на вътрешния стандарт (адонитол) за дадена проба. И за двете платформи, анотирането и разпределението на метаболитите следваха насоките на инициативата за метаболомични стандарти (MSI) за идентификация на метаболитите [41], т.е. Ниво 2: идентификацията се основаваше на спектрална база данни (коефициент на съвпадение> 80%), която се приема за маса на EI-MS спектри, генерирани при 70 eV и ниво 3: известни са само групи от съединения, напр специфични йони и RT области на метаболитите, което води до предполагаема идентификация.

Статистически анализ

Статистическата обработка на двата GC-MS набора от данни беше извършена с помощта на статистически софтуер R (Версия 3.5.1) [42, 43]. Представени са нормализирани, трансформирани, вменени, отстранени извън границите и мащабирани пикови области, представителни за относителните количества метаболити, получени от използването на DeviumWeb [44]. Използвахме прекъсвания с промяна в пъти (FC), превишаващи FC 1.2 до произволни стойности, за да намерим насоченост на промяната за диета (chow срещу HFHC) и пол (мъже срещу жени). Всички отчетени P-стойности са номинални с ограничение за значимост (P, 2)] могат да бъдат оценени от дисперсионните компоненти [47]. Стойностите на P за оценките на наследствеността се получават чрез тестове за съотношение на вероятността, където се изчислява вероятността за модел и се сравнява с вероятността за модел, в който наследствеността е ограничена до нула. Два пъти разликата в естествената логаритмична вероятност се разпределя асимптотично като смес 1/2: 1/2 от променлива χ 2 с една степен на свобода и точкова маса при нула [48].

Резултати и дискусия

Неотдавнашно проучване в кохорта от 112 павиана показа, че мерките за липопротеините са свързани с тежестта на атеросклеротичните лезии в този NHP [34]. В подгрупата на тази кохорта използвахме нецелеви метаболомичен подход, базиран на МС, за да идентифицираме циркулиращите серумни метаболити в бабуните преди (изходно ниво, 0 d) и след 2-годишно предизвикателство с диета HFHC в този модел на атеросклероза. Това дългосрочно предизвикателство с диетата има потенциал да позволи идентифициране на наследствени метаболити, предсказващи атеросклероза, да даде биомаркери на метаболит на базата на серум на атеросклеротична лезия и да осигури нови биомаркери за ранно откриване/диагностика на атеросклероза.

Клинични мерки и резултати от мазнини в резултат на промени, предизвикани от диетата

При 60-те бабуина на изходно ниво (0 d) не наблюдаваме значителни разлики (P,> 0,05) във възрастта, телесното тегло (BW) и HDL-C сред мъжете (n = 26) или жените (n = 34) бабуини. Освен това забелязахме, че нивата на BW (P, 6.044E-06), глюкоза (P, 0.0303), LDL-C (P, 3.113E-21) и TG (P, 0.00003) са значително различни за изходното ниво (0 г) в сравнение с HFHC диетични (2 г.) бабуини (Маса 1; S1 Таблица). Освен това се наблюдават значителни разлики между мъжете и жените за TG (P, 0,00024), LDL-C (P, 0,00035) и общия холестерол (P, 0,00014) (Фигура 1А).

Промени в клиничните измервания на 60 животни и индекси на мазнини за мъже (n = 26) и жени (n = 34) в [A] изходно ниво и в [B] края на 2-годишното диетично предизвикателство. Осигурени са също така [° С] данни за лезии за 2-годишна диетична интервенция. Стойностите са представени като средна стойност +/- стандартна грешка на средната стойност (SEM). Извършеният анализ беше непараметричен двустранен t-тест, сравняващ пропорционалното нормализиране с пропорцията между мъжете и жените и чау и HFHC диетична намеса. P-ти и 75-и процентили, определени от статистическия софтуер R; мустаците се разширяват 1,5 пъти в интерквартилния диапазон от 25-ия и 75-ия персентил, а отклоненията са представени с точки; кръстовете представляват примерни средства; точките с данни са нанесени като черни точки. Ширините на кутиите са пропорционални на квадратните корени на броя на наблюденията.

В действителност, в оригиналното проучване със 112 павиана, концентрациите (или дейностите) на по-голямата част от циркулиращите биомаркери на метаболизма на липидите/липопротеините и възпалението показват средни промени при животните, хранени с диета, предизвикваща HFHC в продължение на 2 години, но стойностите за HDL- C и LDL-C на 2 години (седмица 104) не се различават значително от тези на изходното ниво (седмица 0) [34]. В края на 2-годишното диетично предизвикателство бяха оценени резултатите от мазнини за горния ръб на сърцето, сърцето, коронарната артерия и бъбреците (Фигура 1В; S1 Таблица). Отбелязахме значителни промени в TG (P, 0,00703) и мазнини като сърдечна оценка на горната част на билото на сърцето (P, 4,75E-13), оценка на мазнините на сърдечната коронарна артерия (P, 4,85e-07) и оценка на общата мастна тъкан в сърцето (P, 4.02E-12), всички тези, чиито мазнини са били значително по-високи за жените, отколкото за мъжете.

По-малките MDA обикновено са по-добри дискриминационни маркери от по-високите стойности.

В литературата има малко информация за половите разлики в изобилието на метаболити, свързани със ССЗ. Липидният метаболизъм очевидно е полов диморфен [82]. Честотата на CAD в кохорта от 14 786 финландски мъже и жени е била

3 пъти по-висока при мъжете в сравнение с жените и смъртността е била

5 пъти по-висока при мъжете, отколкото при жените [83]. Женските макаци, както и жените, са устойчиви на атеросклероза [84]. Нашето проучване разкри също така секс-диморфизъм в изобилие от метаболити при бабуините (Фигура 3, таблица S5). Например, 11-метилдедеканол, декандиоена киселина, тирозин и глицин са били значително (P, Фиг. 3. Относителни количества метаболити, които са значително (ANOVA, P Фиг. 4. Анализ на основните компоненти (PCA), показващ Chow (червен) и HFHC диета ( cyan) хранени проби бабуни, групирани, както и поява на нов по-малък клъстер, състоящ се от 32 проби павиани.