Алопуринол подобрява метаболитния синдром, предизвикан от диета с висока фруктоза, чрез регулиране на рецепторите на адипонектин и експресирането на хем оксигеназа-1 при плъхове

G. Mostafa-Hedeab 1,2, Mary Shahataa 1, E. Fouaad Ali 3, Dina Sabry 4, EL-Shaymaa EL-Nahass 5, Manal Hassan 6 и Fatma Mahmoud 3

синдром

1 Факултет по фармакология, медицински факултет, Университет Бени Суеф, Египет.

2 Факултет по фармакология, Медицински факултет, Университет Al Jouf, Саудитска Арабия.

3 Факултет по фармакология, Медицински факултет, Университет в Кайро, Египет.

4 Факултет по биохимия и молекулярна биология, Медицински факултет, Университет в Кайро, Египет.

5 Факултет по патология Факултет по ветеринарна медицина, Университет Beni Suef, Египет.

6 Факултет по биохимия и молекулярна биология, Медицински факултет, Университет Beni Suef, Египет.

Резюме

Ключови думи

Алопуринол; Адипонектин R1/R2; метаболитен синдром на хем оксигеназа-1;

Mostafa-Hedeab G, Shahataa M, Ali E. F, Sabry D, EL-Nahass E. S, Hassan M, Mahmoud F. Allopurinol Ameliorates High Fructose Diet-Induced Metabolic Syndrome чрез up-regulation of Adiponectin Receptors and Heme oxygenase-1 Изрази в плъхове. Biomed Pharmacol J 2017; 10 (4).

Mostafa-Hedeab G, Shahataa M, Ali E. F, Sabry D, EL-Nahass E. S, Hassan M, Mahmoud F. Allopurinol Ameliorates High Fructose Diet-Induced Metabolic Syndrome чрез up-regulation of Adiponectin Receptors and Heme oxygenase-1 Изрази в плъхове. Biomed Pharmacol J 2017; 10 (4). Достъпно от: http://biomedpharmajournal.org/?p=17328

Въведение

Метаболитният синдром (MS) е група от дислипидемия, повишено кръвно налягане, IR и коремно затлъстяване. 1 Съществува силна връзка между компонентите на МС и хиперурикемията. 2 Алопуринол е лекарство, което потиска ксантиноксидазната активност, водеща до намалено образуване на свободни радикали, медиирано от пикочна киселина и ксантиноксидаза. 3

Адипонектинът е хормон, произвеждан както от бели, така и от кафяви мастни тъкани. Той модулира поредица от метаболитни процеси като регулиране на глюкозата в кръвта и окисляване на мастни киселини. 4 Той се счита за ключов протеин, който регулира инсулиновата активност и намалява възпалителния процес на тъканите. Междувременно намалява системната инсулинова резистентност (IR) и като цяло прогнозира сърдечно-съдови заболявания. Действието на адипонектин се медиира главно чрез адипонектинов рецептор един и два (AdipoR1/R2).

HO-1 е ензим, който, ако се индуцира, разгражда хема до железно желязо, биливердин и въглероден оксид (CO) в еднакво моларно количество. 6 След стрес се предизвиква HO-1, което води до важна роля в защитата на клетката от нараняване. 7

Азотният оксид (NO), генериран от ендотелни клетки от L-аргинин, присъства в три различни форми на синтеза: невронна (nNOS), индуцируема (iNOS) и ендотелна (eNOS), сред които NO, генерирана от eNOS, играе важна защитна роля чрез запазване на чернодробната кръвен поток, предотвратяване на адхезия на левкоцити, намаляване на агрегацията на тромбоцитите и премахване на свободните радикали. 8

Настоящото проучване беше да се оцени действието на алопуринол върху МС, произведено от HFD, подчертавайки възможното въздействие на AdipoR1/R2, HO-1 и eNOS в различни тъкани.

Материали и методи

Наркотици и химикали

Алопуринол: Zyloric таблетки, 100 mg (GSK, Египет). Всички таблетки се стриват в дестилирана вода и се оставят за пълно разтваряне.

Фруктоза: Унифруктоза на прах, закупена от Universal Industrial Pharmaceutical Co. (UNIPHARMA) - Египет.

Животни

Включени са двадесет и един мъжки плъхове Sprague Dawley (тегло 140-155gm), които се обработват в съответствие с насоките на местния етичен комитет, които се съгласяват с тези на Helenski, след което животното поставя в метални клетки с 12 часа тъмнина и 12 часа светлина всеки ден, разрешена една седмица безплатно преди започване на експеримента за аклиматизация. Протоколът за тази работа е приет от етичния комитет на медицинския колеж Beni Suef, Египет.

Стандартна диета, съставена от 9,2% мазнини, 52,8% въглехидрати и 38% протеини, се използва за хранене на плъхове, с безводен достъп, класифицирани в две групи.

Група А (нормална контролна група): Седем плъха получиха стандартна чау диета и носител (вода, 1 ml/kg).

Група Б: Четиринадесет плъха получават HFD, състоящ се от фруктоза и нормална дъвчеща диета в пропорция 6: 4 за 8 седмици (до края на експеримента). 9 Група В допълнително беше разделена на две групи, по седем плъха във всяка:

Група B1: получи само HFD и дестилирана вода 1 ml/kg през устата.

Група В2: получава алопуринол (5 mg/kg) перорално.

Алопуринол и дестилирана вода се дават ежедневно, започвайки от 4-та седмица и продължават четири седмици след това.

До края на 8-та седмица BW и кръвното налягане (средно (MBP), систолното (SBP) и диастолното (DBP)) на всички плъхове бяха регистрирани цифрово чрез неинвазивен анализ на кръвното налягане с помощта на сфигмоманометър на маншета метод (Биосинтезна биотехнология TSE-система, Хомбург, Германия). Три пъти се измерва кръвното налягане и се получава средната стойност на това измерване, след което всички плъхове се умъртвяват, теглото на бъбреците, черния дроб, сърцето, далака и панкреаса на всеки плъх се записва преди PCR и хистопатологията.

Биохимично изследване

Под инхалационна анестезия се взема проба от 5 ml кръв след най-малко 6-8 часа на гладно (на гладно през нощта), центрофугирана при 804,96 g в продължение на 20 минути. и серумът се съхранява при -20 ° C в чисти флакони. Нивата на инсулин, глюкоза (Monobind Inc., САЩ), серумна пикочна киселина (SUA), липопротеинов холестерол с ниска плътност (LDL-c), липопротеинов холестерол с висока плътност (HDL-c), триглицериди (TGs), креатинин, урея в кръвта азот (BUN) (Biodiagnostic, Египет) бяха оценени с помощта на специфични комплекти, следвайки насоките на неговите производители.

Изчисляване на хомеостазата на инсулинова резистентност (HOMA-IR; IR индекс)

хомеостазата на IR (HOMA-IR) е изчислена съгласно Matthews et al. 1985 г., като се използва следното уравнение: HOMA-IR = глюкоза на гладно (mg/dL) × инсулин на гладно (µU/L)/405. 10

Анализ на адипонектиновия рецептор едно и две (адипо R1/R2) (ADIPO R1/2), хем оксигеназа-1 (HO-1) и анализ на експресия на ендотелна азотна оксид синтаза (eNOS) в панкреатична, чернодробна, бъбречна и сърдечна тъкани:

Екстракция на РНК

Общата РНК беше извлечена от панкреаса, черния дроб, бъбреците и сърдечните тъкани от всички изследвани групи в съответствие с инструкциите на производителя, като се използва QIamp РНК комплект, предоставен от QiagenInc, САЩ. За да се оцени пречистването, извлечената РНК се определя количествено чрез спектрофотометрия при 260 nm.

PCR в реално време (RT-PCR)

Направени са RT-PCR експерименти за откриване на HO-1, eNOS, рецептор за адипонектин1 (AdipR1) и рецептор за адипонектин2 (AdipR2), като се използват съответните последователности от праймери, както е показано в (Таблица 1). cDNA се синтезира от 1000 ng от екстрахираната РНК с 1 uL (20 pmol) антисенс праймер и 0,8 ml надписан инвертивен транскриптаза на птичи миелобластозен вирус (AMV) за около 60 минути при 37 ° C. Универсален микс от бърз старт Syber Green Master (Thermo Scientific) е използван в Applied Biosystem Instrument със софтуерна версия 2.1 (StepOne ™, САЩ). Накратко бяха приготвени 20 uL, от които 5 pL синтезирана cDNA бяха включени за PCR, крайна концентрация от 0.5 тМ от всеки преден и обратен праймер и бяха използвани 12.5 uL смес от Syber Green Master. Условията за колоездене включват ензимно активиране при 95 ° C за 15 минути, последвано от 40 цикъла от 95 ° C за 10 секунди и 60 ° C за 60 секунди. Целите, които се усилват успешно, се изразяват в Ct стойности или цикъла, при който целевият ампликон първоначално се открива над фоновите нива на флуоресценция, определени от инструменталния софтуер. Всяка RT-PCR проба се извършва поне три пъти. Информационният лист за PCR включва Ct стойности на оценените гени и домашния ген (act-актин). Относителното квантуване на целевите гени се нормализира от.

Таблица 1: Последователности на олигонуклеотидни праймери, използвани за qRT-PCR

Хистопатологично изследване

Светлинна микроскопия

При стайна температура; проби от черен дроб, сърце и бъбреци бяха събрани и фиксирани в 10% буфериран формалин за 72 часа. Подрязването на пробите беше направено за размер от един кубичен сантиметър. Провеждат се рутинни хистологични процедури (дехидратация, изчистване и влагане на парафин). Секции с дебелина 4-6 μm бяха оцветени с рутинни хематоксилин и еозин и трихромни петна на Masson’s за идентифициране на колаген. 11.

Морфометрия

Извършен е морфометричен анализ на оцветени трихромни срезове на Masson за проби от черен дроб, сърце и бъбреци. Основният параметър за морфометричен анализ бяха измерванията на процентното съдържание на колагена. Измерванията бяха извършени в тридесет неприпокриващи се на всеки плъх при x100 (за чернодробни образци) и x200 (за сърдечни и бъбречни образци) увеличение.

Статистически анализ

Данните са представени като Средно ± SD

* Значително в сравнение с нормалната контролна група (P стойност 12

Лечение с алопуринол, подобрено BW, индуцирано от HFD. Предишни резултати показват, че нивата на SUA са свързани с мускулните и мастните маси. 13 Благоприятният ефект на алопуринола при намаляване на телесното тегло (BW) може да бъде чрез антихиперурикемичния ефект. 14.

HFD води до индукция на хипертония, която последователно се обръща от алопуринол. Настоящият резултат е в съответствие с други експериментални 15 и клинично проучване също. 16.

Хиперурикемията може да предразположи към хипертония чрез стимулиране на производството на Ang II и оксидативен стрес, медииран от AT1 17, или чрез увеличаване на чувствителността на проксималните тубули към циркулиращия Ang II. 18.

Ендотелната азотно-оксидна синтаза (eNOS) произвежда NO, който е мощен вазодилататор. Той засилва действието на ацетилхолин, брадикинин и вещество Р в съдовите легла чрез индукция на релаксация на гладката мускулатура. 19 В настоящата работа хипертонията в групата с HFD е свързана със значително намаляване на нивото на eNOS, което последователно се обръща от алопуринол в повечето тъкани.

SUA играе важна роля за обострянето на IR. 20 Може да увеличи производството на чернодробна глюконеогенеза чрез стимулиране на аденин моно фосфат деаминаза (AMPD) и инхибиране на ензимната активност на AMP активирана протеин киназа (AMPK). AMPD стимулира чернодробната глюконеогенеза. 21 Намалява производството на eNOS, което е от съществено значение за стимулираното от инсулина усвояване на глюкоза. 22.

AdipoR1 и R2 играят важна роля в in vivo регулирането на метаболизма на глюкозата и инсулиновата чувствителност. 23 Свързването на адипонектин с неговите рецептори води до транслокация на глюкозния транспортер 4 към клетъчната мембрана, което води до повишен транспорт на глюкоза и насърчава синтеза на гликоген 24, което води до подобряване на IR.

В настоящото проучване HFD значително повишава кръвната глюкоза, инсулин и IR едновременно с намалени нива на експресия на AdipoR1/R2 във всички изследвани тъкани (черен дроб, бъбреци, сърце и панкреас), които корелират със значително намаляване на eNOS в черния дроб, бъбреците и сърдечни тъкани от HFD група (В1) в сравнение с група А.

Намаляването на AdipoR1/R2 и eNOS сигнализирането води до намаляване на ефикасността на адипонектин, което води до IR. 25 Също така, повишеното регулиране на AdipoR1 или AdipoR2 в черния дроб на db/db мишки значително подобри диабета. 23 Въз основа на това мнение, използването на AdipoR1/R2 агонисти или други агенти, които увеличават експресията на AdipoR1/R2, може да осигури ново лечение за IR и диабет тип 2.

В настоящото проучване алопуринолът значително намалява нивото на инсулин, свързано с повишаване на регулирането на панкреаса AdipoR1/R2; освен това, Allopurinol нормализира панкреатичната AdipoR2 сигнализация, докато съществени разлики в eNOS сигнализирането в сравнение с HFD групата, което показва, че алопуринолът може да регулира секрецията на инсулин главно поради по-високо регулиране на AdipoR1/R2.

Глюкозата на гладно отразява основно производството на чернодробна глюкоза, 26 глюкозата и HOMA-IR отразяват главно чернодробната инсулинова резистентност. В настоящата работа алопуринолът намалява кръвната глюкоза и IR в сравнение с HFD групата с възстановяване на нормалната чернодробна архитектура, това се провежда заедно с увеличаване на чернодробната експресия на AdipoR1/R2 и eNOS. Изненадващо, алопуринолът нормализира IR, нивото на глюкозата, което показва, че алопуринолът може да нормализира нивото на глюкозата чрез комбинирано регулиране на експресията на AdipoR1/R2 и eNOS в чернодробните тъкани.

Алопуринолът значително намалява нивата на креатинин и BUN в сравнение с групата с HFD, докато има незначителни разлики в сравнение с групата носители, т.е. той нормализира тези параметри.

Алопуринолът медиира бъбречна защита чрез повишена експресия на eNOS и HO-1 в сравнение с групата на HFD, това е свързано с значително подобрение на съдържанието на колаген при съответното хистологично изследване или индиректно чрез подобряване на глюкозния и IR статус.

HO-1 е индуцируем ензим, който разгражда хема, за да образува еднакво моларно количество въглероден оксид (CO), железно желязо и биливердин. 6 След стрес се предизвиква HO-1, което води до важна роля в защитата на клетката от нараняване. 7 HO-1 предпазва от съдови заболявания чрез насърчаване на жизнеспособността и функцията на ендотелните клетки 27 чрез генериране на CO, което притежава мощни антиапоптотични свойства или чрез генериране на биливердин и билирубин от катаболизма на токсичен свободен хем, който притежава мощни антиоксидантни активности. 28

Алопуринолът значително подобрява нивата на общия холестерол, TG, HDL-c и LDL-c в сравнение с тези в групата с HFD, тези резултати се провеждат в друго проучване при плъхове, хранени с фруктоза. 29

Подобряването на алопуринол при дислипидемия е свързано с регулиране на AdipoR1/R2 нагоре или като последица от изразите на eNOS.

AdipoR1/R2 регулират липидния метаболизъм чрез увеличаване на активността на AMP-активираната киназа (AMPK) и PPARs. Свързването на адипонектин с AdipoR1/R2 води до защита от апоптоза; докато адипонектин - чрез неидентифициран адипонектинов рецептор активира NF-kB, което води до увеличаване на макрофагите IL-6. 23.

В настоящото проучване беше извършено откриване на пролиферация на колагенови влакна или фиброза чрез използване на оцветени с парафин секции на Masson’s Trichrome (MT). Тежка степен на фиброза може да бъде в различни органи на група, лекувана с HFD (B1), включително черен дроб, бъбреци и сърца с най-висок процент на площ на колаген в сравнение с други групи. Подобна констатация се подкрепя от други проучвания, в които се споменава, че диетата, богата на фруктоза, насърчава оксидативния стрес и ROS да регулира CD36 и впоследствие провокира възпаление на NLRP3 по зависим от TLR4/6-IRAK4/1 начин, водещ до насърчаване на фиброза и възпаление при плъхове, страдащи от метаболитен синдром. 30 Освен това не може да се установи значителна разлика в фиброзата между носител и група, лекувана с алопуринол. Нашите резултати, подкрепени от Kang et al. които доказаха кардиозащитния ефект на алопуринол срещу HFD индуцирано възпаление и фиброза. 30

Заключение

алопуринолът може да представлява добър агент за подобряване на компонентите на МС, евентуално чрез регулиране нагоре на адипо R1/R2, HO-1 и eNOS- в различни тъкани; обаче са необходими повече експериментални и клинични проучвания, за да се прецени очакваната полза от алопуринол спрямо страничните ефекти, свързани с продължителната употреба.