Резюме

Заден план

Митохондриите играят централна роля в регулирането на енергийния метаболизъм, а биогенезата на митохондриите се засилва от действието на азотен оксид (NO), който е ключовата сигнална молекула в регулацията на съдовата хомеостаза. Нарушението в регулацията на енергийния метаболизъм може да бъде ключова причина за формирането на инсулинова резистентност и захарен диабет тип 2. Освен това, митохондриалната дисфункция води до оксидативен стрес, който увеличава производството на проинфламаторни цитокини. Във връзка с това, целта на това проучване беше да се идентифицира връзката на броя на копията на mtDNA в мастната тъкан от различни места (подкожна мастна тъкан (SAT), мезентерия (Mes), по-голям омент (GO)), проби от чернодробна биопсия и мононуклеарни кръвни клетки (MNC) с маркери за ендотелна дисфункция (eNOS, ET-1, iCAM-1, vCAM-1, VEGF) и възпалителни медиатори (TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, лептин) при пациенти със затлъстяване (индекс на телесна маса (ИТМ)> 35 kg/m 2) със и без диабет тип 2.

Методи

Проучването включва 88 пациенти със затлъстяване (ИТМ> 35 kg/m2), лекувани в болницата в Калининградска област. Контролната група се състоеше от 20 здрави донори. За измерване на mtDNA номер на копие използвахме капкова цифрова PCR. Концентрациите на молекули (TNF-α, IL-6, IL-8, VEGF, eNOS, ET-1, iCAM-1, vCAM-1, VEGF) са измерени в плазмата, като се използват следните сандвич ензимно свързани имуносорбентни анализи (ELISAs ). Количественото определяне на лептина се оценява чрез поточна флуориметрия върху «Bio-Plex Protein Assay System». Статистически анализ и графики са получени в R Statistics Software (версия 3.3.1).

Резултати

Установява се системният характер на хроничното субклинично възпаление при затлъстяване и се наблюдава повишаване на нивото на молекулите на ендотелната дисфункция в кръвната плазма. Нивата на TNF-a, IL-6 и IL-8 са положително корелирани с повишаване на ИТМ, нива на серумна глюкоза и холестерол.

Заключения

Броят на копията на mtDNA в различни мастни запаси е по-висок при пациенти със затлъстяване с диабет тип 2, отколкото при пациенти със затлъстяване без диабет или при контролните субекти и е свързан с нивата на лептин и провоспалителни цитокини.

Заден план

Митохондриите са привлекателна цел за профилактика и лечение на затлъстяването и неговите усложнения [1]. Митохондриите играят централна роля в регулирането на енергийния метаболизъм, сигнализиране и апоптоза [2]. Наскоро беше установено, че биогенезата на митохондриите се засилва от действието на азотен оксид (NO), който е ключова сигнална молекула в регулацията на съдовата хомеостаза, което показва, че промените в производството или бионаличността на NO могат да бъдат свързани с функциониране на митохондриите [3]. Въпреки това, връзката между сигналните компоненти на NO и митохондриите, както и метаболитните нарушения на затлъстяването в различни тъкани, все още не е ясна.

Нарушението в регулацията на енергийния метаболизъм в инсулинозависимите тъкани може да бъде ключова причина за формирането на инсулинова резистентност [2, 3]. По-специално е доказано, че митохондриалната дисфункция води до оксидативен стрес, който инициира развитието на атеросклероза, сърдечно-съдови заболявания и инсулинова резистентност [4, 5]. Промените в нивото на mtDNA в левкоцитите в периферната кръв също могат да доведат до оксидативен стрес и да корелират с развитието на метаболитен синдром [6]. Нашите предишни данни показват намаляване на броя на копията на mtDNA в мононуклеарни кръвни клетки (MNC) и увеличаването им в подкожната мастна тъкан (SAT) [7].

Във връзка с това, целта на това проучване беше да се идентифицира връзката на броя на копията на mtDNA в мастните тъкани на различни места (SAT, мезентерия (Mes), по-голям омент (GO)), проби от чернодробна биопсия и MNC с маркери за ендотелна дисфункция (eNOS, ендотелин-1 (ET-1), молекула на междуклетъчна адхезия 1 (iCAM-1), молекула на адхезия на съдови клетки 1 (vCAM-1), фактор на растеж на съдовия ендотел (VEGF)) и медиатори на възпаление (TNF-α, IL -6, IL-8, С-реактивен протеин (CRP), лептин) при пациенти със затлъстяване (индекс на телесна маса (ИТМ)> 35 kg/m 2) със и без диабет тип 2.

Материали и методи

Учебни предмети

Проучването включва 88 пациенти със затлъстяване, лекувани в болницата в Калининградска област. Контролната група се състоеше от 20 здрави донори (ИТМ = 22,3 ± 3,1 kg/m 2) с антропометрични и биохимични измервания на липидния и въглехидратния метаболизъм в здравословен диапазон.

Пациентите с абдоминално затлъстяване са класирани според състоянието на въглехидратния метаболизъм, както следва: 54 пациенти с T2DM (BMI = 42,9 ± 8,45 kg/m 2) и 34 пациенти без T2DM (BMI = 41,6 ± 4,5 kg/m 2).

Контролната група и пациентите със затлъстяване със и без диабет тип 2 са сравними по пол и възраст.

Пробите, използвани за изследването, са периферна венозна кръв (MNC), мастна тъкан (SAT, Mes и GO) и чернодробна тъкан. Пациентите бяха назначени в учебните групи от ръководителя на отделението по реконструктивна и пластична хирургия П.А. Д-р Затолокин в Регионалната клинична болница на Калининградска област. Взети са проби от биопсия на мастна тъкан по време на рутинни лапароскопски операции при пациенти. Техническият процес за извършване на бариатрични операции е стандартизиран съгласно методическите препоръки за бариатричните хирурзи (http://www.ifso.com/). RYGB беше извършен с помощта на техниката Lonroth. Материалите, използвани в настоящото проучване, са проби от венозна кръв, взети от пациенти на гладно сутрин.

Проверка

Наличието на затлъстяване и T2DM е установено въз основа на подробен клиничен и инструментален преглед в специализирана болница, ръководен от критериите на Световната здравна организация (1999–2013) за диагностициране на диабет и други видове хипергликемия. Информирано съгласие е подписано от всички пациенти. Проверката на диагнозата и набирането на пациенти в изследваните групи бяха извършени в отделението по реконструктивна и пластична хирургия на базата на регионалната клинична болница в Калининград.

Разрешение за провеждане на изследването е получено от местната комисия по етика (протокол № 4 от заседанието на Местната комисия по етика в Иновационния парк на Федералния университет на Имануел Кант от 23 октомври 2013 г.).

Химия на кръвта

Медиатори на въглехидратния и липидния метаболизъм (глюкоза, холестерол, липопротеини с висока плътност (HDL), липопротеини с ниска плътност (LDL), триглицериди, CRP) бяха измерени на автоматичен биохимичен анализатор CA-180 (Furuno Electric Co., Ltd., Япония).

Имунособентен анализ, свързан с ензимите

Концентрациите на молекули (TNF-α, IL-6, IL-8, VEGF) са измерени в плазмата, като се използват следните сандвич ензимно свързани имуносорбентни анализи (ELISA): Alfa-TNF-IFA-BEST, Interleukin-6-IFA- BEST, Interleukin-8-IFA-BEST, VEGF-IFA-BEST (Vector-Best kits, Russia; BIO Vendor, Czech Republic) в анализатор на лазурит (Dynex Technologies Inc., САЩ). Концентрациите на eNOS и ендотелин-1 бяха измерени в серум/плазма, като се използва ELISA комплект за азотен оксид синтаза 3 ендотел (NOS3) (Cloud-Clone Corp., САЩ) и ендотел 1–21 комплект (Biomedica, Австрия). Концентрациите на разтворими циркулиращи форми на iCAM-1 и vCAM-1 бяха измерени в серум/плазма, като се използва човешка междуклетъчна адхезионна молекула 1, ICAM-1 ELISA Kit и и адхезионна молекула 1 на човешки съдови клетки, VCAM-1 ELISA комплект (Cusabio Biotech Co., Ltd., САЩ).

Проточна цитометрия

Количественото определяне на лептин беше оценено чрез флуориметрия на потока върху автоматизиран лазерен анализатор «Bio-Plex Protein Assay System» (Bio-Rad, САЩ), използващ търговска тест система Bio-Plex Pro Human Diabetes 10-Plex Assay (Bio-Rad, USA) . Методът се състои в свързването на изследваните молекули със специфични антитела, адсорбирани на повърхността на микросферите (магнитни гранули), което позволява да се определят до 100 аналити в една ямка. Резултатите бяха отчетени с помощта на автоматичен микрометров фотометър Bio-Plex-200 System (Bio-Rad, САЩ) и софтуера Bio-Plex Manager (Bio-Rad, САЩ). Концентрациите на лептин бяха определени с помощта на стандартна крива (определен динамичен диапазон от 2–32 000 pg/ml) в съответствие с инструкциите на производителя.

Капкова цифрова PCR

Екстракцията на ДНК от мастните тъкани (SAT, Mes и GO), MNC и чернодробната тъкан се извършва с помощта на търговски QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, САЩ). Концентрацията на ДНК в пробите беше измерена с спектрофотометър Implen NanoPhotometer. Номерът на mtDNA копие се определя чрез ddPCR. Екстрахираните ДНК проби бяха предварително обработени с ApaI рестрикционна ендонуклеаза (New England Biolabs, Ipswich, USA). Компонентите на ddPCR включват търговски 2x ddPCR Master Mix (Bio-Rad, Pleasanton, USA), флуоресцентни TaqMan сонди и олигонуклеотидни праймери, а реакционната смес се зарежда в автоматичен генератор на капчици (Bio-Rad, Pleasanton, USA).

Емулгираната смес ddPCR се прехвърля в стандартни 96-ямкови плаки и се амплифицира в термоциклер (Bio-Rad T100 термоциклер), съгласно следния температурен протокол: 95 ° C за 10 минути, 40 цикъла при 94 ° C за 30 s и 53 ° C за 60 s и финален цикъл при 98 ° C за 10 min. След реакцията на усилване, силата на флуоресценцията се измерва с помощта на QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, Pleasanton, CA). Данните бяха анализирани с програмния пакет QuantaSoft (версия 1.7.4.0917). Абсолютният брой копия на mtDNA на клетка се изчислява по методите, описани по-долу, като се използва формула:

Статистически анализ

Проверката на нормалността на количественото разпределение на показателите беше извършена с помощта на теста Shapiro-Wilk. Тъй като изследваните проби отговарят на нормално разпределение, хипотезата за равенството на средните стойности на пробите беше проверена с помощта на t-тестове на Student. За да се оцени значимостта на разликите между независими количествени проби, които не следват нормален закон за разпределение, беше използван непараметричният тест на Kruskal-Wallis. За откриване на статистически значими разлики между групите е извършен анализ по двойки с помощта на теста на Ман-Уитни. Разликите се считат за значителни на ниво стр 0,05), неговото нормално разпределение и консистенцията на дисперсионните остатъци (тест за хетероскедастичност, р-стойности

Резултати

Пациентите със затлъстяване имат признаци на нарушения на липидния метаболизъм при наличие и отсъствие на диабет тип 2. По-високо ниво на LDL и по-ниско ниво на HDL са регистрирани в групата пациенти с диабет тип 2, отколкото в контролната група. Нивата на HDL и триглицеридите са по-високи при пациенти без диабет тип 2, отколкото при контролите (Таблица 1).

Съдържанието на CRP в серума при пациенти със затлъстяване надвишава това на контролните субекти, достигайки максималните стойности при пациенти с диабет тип 2 (Таблица 1).

При всички пациенти със затлъстяване се наблюдава повишаване на нивата на възпалителни молекули - IL-6, IL-8 и TNF-a - и маркер за метаболитни нарушения на лептина в кръвната плазма по отношение на тези при контролните субекти (Таблица 2). Концентрациите на тези фактори са по-високи при пациенти с диабет тип 2, отколкото при пациенти без диабет (Таблица 2).

Увеличение на броя на копията на mtDNA в мастните тъкани на Mes и SAT и намаляване на mtDNA в MNCs са наблюдавани в групата пациенти с диабет тип 2 в сравнение с тези в контролната група. Освен това, при пациенти с диабет тип 2 е установено увеличаване на броя на копията на mtDNA в GO и намаляване на mtDNA в чернодробните клетки в сравнение с тези при пациенти без диабет тип 2. Броят на копията на mtDNA във всички изследвани тъкани при пациенти без диабет тип 2 не се различава от този на контролните субекти.

Дискусия

При затлъстяването се установява системният характер на хроничното субклинично възпаление [8].

Плазмените нива на проинфламаторните цитокини TNF-a, IL-6 и IL-8 са повишени при всички пациенти със затлъстяване и са положително взаимосвързани (Фиг. 1) (Таблица 2). Освен това, нивата на тези фактори са положително корелирани с ИТМ, нивата на серумна глюкоза и холестерол, а нивата на TNF-a и IL-6 са корелирани със серумните концентрации на LDL. Установените от нас корелации могат да посочат преобладаващата роля на провъзпалителните медиатори при формирането на нарушения в метаболизма на въглехидратите и липидите при пациенти със затлъстяване със и без диабет тип 2 (фиг. 1, таблица 2).

връзката

В литературата данните са неясни по отношение на промените в броя на копията на mtDNA в мастните тъкани при пациенти със затлъстяване [9]. В нашето проучване съдържанието на mtDNA в различни мастни запаси е по-високо при пациенти със затлъстяване с диабет тип 2, отколкото при пациенти със затлъстяване без диабет или при контролни субекти.

Предполагаме, че увеличаването на броя на копията на mtDNA в изследваните биопсични образци на мастните тъкани може да се счита за компенсаторен механизъм, насочен към поддържане на нормална биогенеза на митохондриите в условия на оксидативен стрес, медииран от висока концентрация на възпалителни цитокини. С увреждащия ефект на реактивните кислородни форми (ROS) по време на оксидативен стрес се задейства механизмът на репликация на митохондриалния геном и разделяне на органелата [10]. Горното се подкрепя от положителни корелации между броя на mtDNA в SAT и нивата на проинфламаторни цитокини IL-6 (r = 0,3) и TNF-a (r = 0,4) и отрицателни корелации между mtDNA в MNC и нивата на IL-6 (r = - 0,42) и TNF-a (r = - 0,33) (стр

Заключения

При пациенти със затлъстяване (ИТМ> 35 kg/m 2), независимо от наличието/отсъствието на диабет тип 2, са разкрити системно субклинично възпаление и признаци на ендотелна дисфункция.

Увеличението на броя на копията на mtDNA в изследваните тъкани е взаимосвързано с увеличаването на съдържанието на възпалителни цитокини IL-6, IL-8 и TNF-a в кръвната плазма във всички групи изследвани лица.

Увеличаването на броя на копията на mtDNA в изследваните тъкани е свързано с нарушението на въглехидратния и липидния метаболизъм, както и с увеличаването на съдържанието на ендотел-1 при пациенти със затлъстяване с диабет тип 2.

Увеличаването на броя на копията на mtDNA в мастните тъкани (GO, SAT) и MNC е взаимосвързано с нарушаване на въглехидратния и липидния метаболизъм.