Роли Концептуализация, куриране на данни, официален анализ, разследване, писане - оригинален проект

влияние

Affiliation University of California Riverside, School of Medicine, Division of Biomedical Sciences, Riverside CA, Съединени американски щати

Концептуализация на роли, придобиване на финансиране, разследване, администриране на проекти, надзор, писане - преглед и редактиране

Affiliation University of California Riverside, School of Medicine, Division of Biomedical Sciences, Riverside CA, Съединени американски щати

  • Педро А. Перес,
  • Николай V. DiPatrizio

Фигури

Резюме

Цитат: Perez PA, DiPatrizio NV (2018) Влияние на затлъстяването, предизвикано от майката със западна диета, върху смъртността на потомството и периферната ендоканабиноидна система при мишки. PLoS ONE 13 (10): e0205021. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0205021

Редактор: Джули А. Чоуен, болница Infantil Universitario Nino Jesus, ИСПАНИЯ

Получено: 22 юни 2018 г .; Прието: 18 септември 2018 г .; Публикувано: 1 октомври 2018 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Националните здравни институти безвъзмездна финансова помощ DA034009 и DK114978 за NVD. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Над 70% от възрастните в САЩ са с наднормено тегло или затлъстяване, а детското и юношеското затлъстяване са се утроили повече от 70-те години на миналия век [1–4]. Диета-индуцираното затлъстяване (DIO) може да бъде предотвратено и свързано с прекомерна консумация на храни с високо съдържание на мазнини и захари [т.е. западна диета (WD)], която значително увеличава риска от развитие на диабет тип 2 и други метаболитни заболявания [5, 6]. Освен това има нарастваща честота на затлъстяване при жените в детеродна възраст и увеличаване на гестационния диабет по време на бременност [7, 8]. Доказателствата също свързват гестационния диабет или затлъстяването с повишен риск от развитие на диабет тип 2, както при майките, така и при техните потомци [9, 10]. Изследвания върху модели на гризачи на DIO при майките разкриват промени във вкусовите предпочитания на потомството, реакциите на стрес, затлъстяването и наддаването на тегло; обаче, молекулярните механизми, лежащи в основата на тези поведенчески и метаболитни резултати, са слабо разбрани, но могат да включват дисрегулация на ендоканабиноидната (eCB) система [11–18]. В действителност, значителни доказателства сочат, че системата на eCB играе решаваща роля в приема на храна и енергийния баланс [19–22].

Системата eCB се състои от получените от липиди сигнални молекули, eCB, които включват добре характеризираните 2-арахидоноил-sn-глицерол (2-AG) и анандамид (AEA), както и техните биосинтетични и разграждащи се ензими и рецептори [ т.е. канабиноиден рецептор подтип-1 и подтип-2 (CB1R и CB2R)] [23, 24]. Системата eCB играе важна роля в почти всички физиологични функции, свързани с енергийния баланс, включително ендокринната функция на панкреаса [21]. Активността на CB1R върху β-клетките в панкреаса оказва влияние върху тяхната функция, като директно инхибира сигнализирането на инсулиновия рецептор, както и развитието на панкреасните ендокринни островчета вътреутробно [25–27]. Все повече доказателства предполагат също, че активирането на CB1R в островчетата на Лангерханс стимулира секрецията на инсулин чрез cAMP- и калциево-зависим механизъм [28–31]; други групи обаче съобщават за инхибиторни действия върху секрецията на инсулин [32–34]. Независимо от това, промените в панкреатичната eCB сигнализация по време на развитието могат да предразположат потомството към смущения в глюкозната хомеостаза.

Това проучване има за цел да идентифицира въздействието на WD на майката върху наддаването на телесно тегло на потомството, моделите на хранене и експресията и функцията на системата eCB в избрани периферни органи, важни за приема на храна и енергийния баланс, които включват панкреас, тънкочревен епител и плазма в мишки C57BL/6Tac. Оценена е и смъртността на новородените.

Материали и методи

Животни

Шестседмични мъжки и женски C57BL/6Tac (Taconic, Oxnard, CA, USA) бяха групирани поместени според пола със свободен достъп до вода и храна и поддържани в 12-часов цикъл светлина/тъмнина (светлините се изключват в 1800 часа) . Тестови диети, съставени от стандартна лаборатория за гризачи с ниско съдържание на мазнини/без захароза [(SD) Teklad 2020x Global Soy Protein-Free Extruded Diet Diet; 16% kcal от мазнини, 60% kcals от въглехидрати, без захароза] или западна диета [(WD) Research Diets D127098, New Brunswick, NJ, USA; 40% ккал от мазнини, 43% въглехидрати, предимно захароза) (Таблица 1). Всички процедури отговарят на насоките на Националния институт по здравеопазване на САЩ за грижи и използване на лабораторни животни и са одобрени от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (IACUC) към Калифорнийския университет, Ривърсайд.

Параметри за размножаване

Женските мишки са били хранени или с SD, или с WD по време на предварителната бременност в продължение на 10 седмици, бременността и лактацията. Мъжки мишки получиха достъп само до SD. След 10 седмици мъжки мишки бяха отгледани в харем с женски мишки за чифтосване на 1000 часа и разделени на 1600 часа (вж. Фигура 1 за експериментален дизайн). Храната се отстранява по време на чифтосване и се връща веднага след това, за да се избегне консумацията на диета от мъжки пол. Когато се наблюдава вагинална запушалка по време на чифтосване, женските са настанени единично със съответните им диети, за да раждат. Датите на раждане, размерите на котилата, оцеляването на новородените и цялостното здраве на всички животни се наблюдават ежедневно. Теглото на потомството се записва два пъти седмично. На 21-ия ден след раждането, малките са отбити, маркирани с уши, групирани с мишки със същото състояние (т.е. тези, родени от една и съща тестова диета за майката) и им е даден достъп само до SD за периода на 10-седмичното проучване. Всички бременности са настъпили приблизително на една и съща дата. По този начин резултатът от всички носилки се е случил приблизително на една и съща дата.

Женските мишки бяха хранени със SD или WD в продължение на 10 седмици по време на прегестационния период, след което мъжете бяха въведени за чифтосване. След това женските са били подлагани на съответните диети през целия експеримент. Оцелелите потомци се отбиват от язовирите на 21-ия ден и се поставят на SD за 10 седмици мониторинг на телесната маса. Поведенчески анализ на схемите на хранене са направени след 5-дневен период на аклимация. В края на 10 седмици тъканите в потомството бяха събрани и обработени за анализ на нивата на ендоканабиноидите и експресията на гени за компоненти на ендоканабиноидната система. Тъкани от язовири бяха събрани по време на фазата на прегестация и след 10 седмици на съответната диета. Към този момент също е настъпил поведенчески анализ при язовирите.

Поведение при хранене

Съответстващите на възрастта жени (за тези, използвани в проучвания на майки) и оцелелите потомци бяха разделени в еднокамерни камери за хранене (TSE Systems) и се аклиматизираха в продължение на 5 дни преди тестване на поведението при хранене. Приемът на храна и вода се получаваше на всеки 60 секунди. Изходното поведение на хранене се наблюдава в продължение на 24 часа, за да се оценят моделите на дневен прием. В допълнение беше проведен тест за предпочитание между SD и WD след отчитане на изходното ниво. Животните имаха свободен достъп до двете диети в продължение на 24 часа и тяхното поведение при хранене беше регистрирано. Параметрите на хранене включват общ калориен прием, среден размер на хранене, среден процент на прием, среден брой хранения, средна продължителност на хранене, среден интервал след хранене и процент от общия брой хранения между SD и WD (тест за предпочитание).

Обработка на тъкани

Събиране на тъкани.

Изофлуранът се използва за упойка на животни по време на събиране на тъкани (0900 до 1100 часа). Кръвта се събира чрез сърдечна пункция и се съхранява в облицовани с EDTA епруветки върху лед. Епруветките се центрофугират (1500 g за 10 минути при 4 ° С), за да се получи плазма. Панкреасът бързо се събира, промива се с охладен с лед разтвор на фосфатен буфер (PBS) и се замразява бързо в течен азот. Йеюнумът бързо се събира, измива се с охладен с лед PBS, разрязва се надлъжно върху плоча от неръждаема стомана, държана върху лед, остъргва се със стъклено стъкло, за да се отдели мукозният слой, след което лигавицата се замразява бързо в течен азот. Всички проби се съхраняват при -80 ° C до момента на обработка.

Екстракция на липиди.

Тъканите се претеглят и хомогенизират в 1,0 ml метанолов разтвор, съдържащ вътрешни стандарти: [2 H5] -2-арахидоноил-sn-глицерол (2-AG), [2 H4] -арахидоноилетаноламид (AEA) и [2 H4] -олеоилетаноламид (OEA) (Cayman Chemical, Ан Арбър, Мичиган, САЩ). Липидите се екстрахират с хлороформ (2.0 ml) и се промиват с ултрачиста (0.2 μm филтрирана) вода. Липидите бяха извлечени от плазмата, като се използва стерилен 0,9% физиологичен разтвор вместо вода (0,1 ml плазма за сметка на физиологичен разтвор). Органичните фази бяха събрани и разделени с помощта на колонна хроматография върху силикагел, както беше описано по-рано [40]. Елуатът се изсушава внимателно под N2 поток (99,998% чисто) и се суспендира отново в разтвор на метанол: хлороформ (9: 1) с LCMS клас [100 μL за плазма, 200 μL за тъкан]. 1 μL се инжектира за анализ чрез ултра-ефективна течна хроматография, съчетана с тандемна масспектрометрия (UPLC-MS/MS), както е описано [40, 49].

Липиден анализ.

Генната експресия

статистически анализи

Данните бяха анализирани с помощта на софтуера Graphpad Prism 7.0. Резултатите са изразени като средната стойност ± S.E.M. Значителни разлики между групите бяха оценени с помощта на двустранен t-тест на Student или двупосочен дисперсионен анализ (ANOVA) с повтарящи се или неповторяеми измервания съответно с Sidak или Newman-Keuls анализ. Кривите на оцеляване са анализирани с помощта на тестове Mentel-Cox и Gehan-Breslow-Wilcoxon. Разликите се считат за значими, ако p Фиг. 2. Хроничната консумация на западна диета води до променено поведение при хранене при женски мишки.

Женските мишки, поддържани в продължение на десет седмици (а, кумулативна промяна в телесното тегло; б, брутно телесно тегло) на западна диета (западна), затлъстяват и показват увеличение в рамките на 24 часа размер на хранене и скорост на прием, съчетани с намаляване на продължителността на храненето ( ce) в сравнение с мишки, поддържани на стандартна чау диета (щанд). Честотата на хранене, общият калориен прием, приемът на тъмен цикъл, светлият цикъл и интервалът след хранене не се различават значително между диетите (f-j). Многократно измерване на двупосочна ANOVA, с многократния сравнителен тест на Sidak post hoc, *** = p Таблица 2. Нива на липидите в кръвната плазма, лигавицата на йеюнума и панкреаса.

Женски мишки, хранени с WD, показват промени в ендоканабиноидните и свързаните с тях липидни профили в плазмата и йеюналния епител по време на фазата преди гестацията

Липидите бяха извлечени от кръвна плазма, епител на проксималното тънко черво (йеюнум) и панкреас на женски мишки, поддържани на WD или SD в продължение на 10 седмици (съответстващи на възрастта на мишки, използвани в експерименти на майката по-долу). Женските WD мишки, в сравнение с тези, хранени със SD в продължение на 10 седмици, са имали значително по-високи нива на плазмен AEA (t = 3.025, p = 0.0128) и OEA (t = 3.223, p = 0.01) и намаления в 2-AG (t = 2.654, p = 0.024), но не показва разлики в еюналния епител или панкреаса (Таблица 2). Нивата на по-малко характеризираните DHEA (t = 3.605, p = 0.005) и DHG (t = 2.963, p = 0.014) също бяха намалени и увеличени, съответно, в еюналния епител. Тези резултати са за разлика от мъжките мишки C57BL/6, хранени по подобен начин с WD в продължение на 60 дни, за които се съобщава, че имат повишаване на плазмата и еюналния епител 2-AG и AEA (вж. Нашата [40]). Тези данни подчертават важни полови различия в въздействието на DIO върху периферната система на eCB, което може да е в основата на диференциалните модели на хранене (т.е. общ калориен прием) при жените (фиг. 2) спрямо мъжете (вж. Нашата [40]).

Потомците, родени от DIO майки, имат по-ниски нива на оцеляване

Женските мишки са хранени със SD или WD по време на прегестацията (10 седмици) и фазите на лактация (вж. Фигура 1). Новородените, родени от DIO майки, са имали по-ниски нива на преживяемост в сравнение с мишки, родени на слаби майки (Фигура 3А, HR 0.2309; 95% CI, 0.1032–0.5166, p = 0.0004). Цялата смъртност настъпи през първите шест дни след раждането. Средните размери на постелята на общото потомство, родено между DIO и слаби майки, не се различават по време на раждането (Фигура 3B, t = 0,691, p = 0,528). Средните размери на носилките на оцелелите потомци, родени от майки с DIO, са намалели до 21-ия ден след раждането (фиг. 3C, t = 3,06, p = 0,012). оцелели малки, родени от слаби майки (фиг. 3D, съответно 60% срещу 45%).

Мишките, родени от майки, хранени хронично със западна диета (WD) в продължение на 10 седмици, имат по-нисък процент на оцеляване в сравнение с мишки, родени от майки, хранени със стандартна диета с чау (SD) (a). Размерът на котилото между двете групи е сходен по средния брой малки на деня по време на раждането (b), но намалява при потомството, родено от майки DIO по време на отбиване (c). Установено е увеличение на мъжката фракция в групи, родени от майки, хранени с WD, в сравнение с майки, хранени със SD (d, 60% срещу 45%). Данните за оцеляване бяха анализирани с помощта на тестове на Mantel-Cox и Gehan-Breslow-Wilcoxon, HR 0.2309; 95% CI, 0,1032–0,5166, p = 0,0004. Датата на размера на котилото е анализирана с помощта на несдвоени t-тестове на Student (двустранни): ns = p> 0,05.

Оцелелите потомци показват подобно поведение при хранене между групите

Мъжки (фиг. 4А) и женски (фиг. 5А) потомци, родени от язовири, хранени с WD, са имали по-висока телесна маса по време на отбиване в сравнение с тези, родени от язовири, поддържани на SD; обаче телесното тегло бързо се нормализира през периода на наблюдение на WD мишки до нива, открити при потомство, родено от SD майки. Мъжките потомци не показват разлика в размера на храненето (фиг. 4В, t = 1,16, р = 0,244), степента на прием (фиг. 4С, t = 0,798, р = 0,426), продължителността на храненето (фиг. 4D, t = 0,146, р = 0,146), честота на хранене (фиг. 4E, t = 1,023, p = 0,323), общ калориен прием (фиг. 4F, t = 0,468, p = 0,647), калориен прием в тъмен цикъл (фиг. 4G, t = 1,918, p = 0,066 ), калориен прием на лек цикъл (фиг. 4H, t = 0,276, p = 0,787), интервал след хранене (фиг. 4I, t = 0,449, p = 0,654) или предпочитание между WD и SD (фиг. 4J, t = 0,618, 0,546 ). Женските потомци не показват разлика в размера на храненето (Фигура 5B, t = 0,542, p = 0,589), продължителността на храненето (Фигура 5D, t = 0,446, p = 0,656), честотата на хранене (Фигура 5E, t = 1,609, p = 0,139), общ калориен прием (Фиг. 5F, t = 0,883, p = 0,398), калориен прием в тъмен цикъл (Фиг. 5G, t = 0,938), калориен прием в лек цикъл (Фиг. 5H, t = 0,543, p = 0,599), пост интервал на хранене (Фигура 5I, t = 1,753, p = 0,082) или предпочитание между WD и SD (Фигура 5J, t = 1,048, p = 0,3191). Женските потомци, родени от WD язовири, са имали леко намален процент на прием (Фиг. 5C, t = 2.304, p = 0.023) в сравнение с женските потомци, родени от контролите на SD.

Мъжки потомци, отбити от язовири, хранени със стандартна диета с чау (SD) или със западна диета (WD), получават свободен достъп до стандартна чау в продължение на 8 седмици. Теглото на тялото се проследява и поведението на хранене се тества. Потомството с WD имаше по-висока телесна маса по време на отбиване, но телесното тегло бързо се нормализира през периода на наблюдение (а). Няма разлики в размера на храненето, скоростта на приема, продължителността на храненето, честотата на хранене, общия прием на калории, приема на тъмен цикъл, приема на светлия цикъл или в интервала след хранене (b-i). Потомството също не показва разлика в предпочитанията, когато им се дава избор между консумацията на стандартна чау и силно вкусна западна диета (j). Данни, анализирани с помощта на многократно измерване на двупосочен ANOVA, с многократното сравнение на Sidak post hoc тест, ** = p 0,05 (a); неспарен t-тест на Student (двустранен), ns = p> 0,05 между SD и WD (b-j). Резултатите са изразени като средни стойности ± SEM; n = 8/9 (SD/WD).

Женски потомци, отбити от язовири, хранени със стандартна чау (SD) или западна диета (WD), получават ad libitum достъп до стандартна чау в продължение на 8 седмици. Теглото на тялото се проследява и поведението на хранене се тества. Потомството с WD имаше по-висока телесна маса по време на отбиване, но телесното тегло бързо се нормализира през периода на наблюдение (а). Няма разлики в размера на храненето (а), но леко намаляване на степента на прием между групите (б). Освен това няма разлики в продължителността на храненето, честотата на хранене, общия калориен прием, приема на тъмен цикъл, приема на светъл цикъл или интервала след хранене (d-i). Потомството също не показва разлика в предпочитанията, когато им се дава избор между консумацията на стандартна чау и силно вкусна западна диета (j). Данни, анализирани с помощта на многократно измерване на двупосочен ANOVA, с многократното сравнение на Sidak post hoc тест, ** = p 0,05 (a); неспарен t-тест на Student (двустранен), ns = p> 0,05 между SD и WD (b-j). Резултатите са изразени като средни стойности ± SEM; n = 8/4 (SD/WD).

Оцелелите потомци показват подобни ендоканабиноидни и свързани липидни профили, независимо от диетата на язовира

Липидите бяха извлечени от кръвна плазма, епител на проксималното тънко черво (йеюнум) и панкреас от мъжки и женски потомци от язовири, поддържани на WD или SD в продължение на 10 седмици преди чифтосването и до отбиването (Таблица 2). Независимо от диетата на майките, не са открити промени в нивата на 2-AG, AEA или OEA в плазмата, еюналния епител или панкреаса; обаче плазмените нива на DHG (t = 2,727, p = 0,017) при мъжки потомци, родени от WD майки, и DHEA (t = 2,955, p = 0,018) при женски потомци, родени от WD майки, са умерено намалени.

Мъжки потомци показват промени в експресията на иРНК за избрани компоненти на ендоканабиноидната система в еюналния епител

Експресията на mRNA, кодираща MGL, е значително по-ниска в горния тънкочревен епител на потомство, родено от WD майки, спрямо SD майки. Не са открити промени между групи в експресията на CB1R (Cnr1), CB2R (Cnr2), диацилглицерол липаза α/β (DagLa, DagLb), n-ацил фосфатидилетаноламин фосфолипаза-D (NAPE-PLD) и амидна хидролаза на мастна киселина (FAA) не се различават между тестваните групи в лигавицата на йеюнума (а). В панкреаса Cnr1, Cnr2 и DagLb не показват разлики между тестваните групи, докато експресията на mRNA на DagLa, MGL, NAPE-PLD и FAAH не е открита (b). Данните бяха анализирани с помощта на множество студентски t тестове. * = p Фигура 7. Женски мишки, родени от язовири, поддържани на WD или SD, показват подобна експресия на иРНК на ключови гени на ендоканабиноидна система.

Експресия на mRNA, кодираща CB1R (Cnr1), CB2R (Cnr2), диацилглицерол липаза α/β (DagLa, DagLb), моноацилглицерол липаза (MGL), n-ацил фосфатидилетаноламин фосфолипаза-D (NAPE-хидрохлорид) ) не показва промени между тестваните групи в лигавицата на йеюнума (а). В панкреаса Cnr1, Cnr2 и DagLb не показват разлики между тестваните групи, докато експресията на mRNA на DagLa, MGL, NAPE-PLD и FAAH не може да бъде определена количествено с описаните техники (b). Данните бяха анализирани с помощта на множество студентски t тестове. ns = не е значително. Резултатите са изразени като средни стойности ± SEM; n = 4 за условие в три екземпляра. LE = ограничен израз.

Дискусия

Тези проучвания предполагат, че диетата на майката е важен предиктор за оцеляване при новородени мишки C57BL/6Tac и WD на майката не е свързана с нарушения в схемите на хранене или изразени аномалии в експресията на системата на eCB или функцията в еютелиалния епител, панкреаса или плазмата при оцелелите потомци поддържа се на SD в продължение на 10 седмици.

Заключения