Група за кардиометаболитни изследвания (CMRG), Департамент по физиологични науки, Университет Стеленбош, Стеленбош 7600, Южна Африка

инхибитори

Група за кардиометаболитни изследвания (CMRG), Департамент по физиологични науки, Университет Стеленбош, Стеленбош 7600, Южна Африка

Институт за сърце на McAllister, Катедра по патология и лабораторна медицина, Университет на Северна Каролина, Chapel Hill, Северна Каролина, САЩ

Институт за сърце на McAllister, Катедра по патология и лабораторна медицина, Университет на Северна Каролина, Chapel Hill, Северна Каролина, САЩ

Институт за сърце на McAllister, Катедра по патология и лабораторна медицина, Университет на Северна Каролина, Chapel Hill, Северна Каролина, САЩ

Институт за сърце на McAllister, Катедра по патология и лабораторна медицина, Университет на Северна Каролина, Chapel Hill, Северна Каролина, САЩ

Affiliation Groupe d'Etude sur l'Inflammation Chronique et l'Obésité (GEICO), Plateforme CYROI, Université de La Réunion, Saint Denis de La Réunion, Франция

Affiliation Groupe d'Etude sur l'Inflammation Chronique et l'Obésité (GEICO), Plateforme CYROI, Université de La Réunion, Saint Denis de La Réunion, Франция

Affiliation Groupe d'Etude sur l'Inflammation Chronique et l'Obésité (GEICO), Plateforme CYROI, Université de La Réunion, Saint Denis de La Réunion, Франция

Affiliation Groupe d'Etude sur l'Inflammation Chronique et l'Obésité (GEICO), Plateforme CYROI, Université de La Réunion, Saint Denis de La Réunion, Франция

Група за кардиометаболитни изследвания (CMRG), Департамент по физиологични науки, Университет Стеленбош, Стеленбош 7600, Южна Африка

  • Катлийн М. С. Е. Рейскенс,
  • Тарин-Лий Фишър,
  • Джонатан С. Шислер,
  • Уенди Г. О'Конър,
  • Арлин Б. Роджърс,
  • Монте С. Уилис,
  • Синтия Планес,
  • Флорънс Бойер,
  • Филип Рондо,
  • Еманюел Бурдон

Корекция

26 ноември 2013 г .: Reyskens KMSE, Fisher TL, Schisler JC, O'Connor WG, Rogers AB, et al. (2013) Корекция: Сърдечно-метаболитни ефекти на ХИВ протеазни инхибитори (Lopinavir/Ritonavir). PLOS ONE 8 (11): 10.1371/анотация/a1e2a42f-7f10-4654-a042-57d19de50208. https://doi.org/10.1371/annotation/a1e2a42f-7f10-4654-a042-57d19de50208 Преглед на корекцията

Фигури

Резюме

Цитат: Reyskens KMSE, Fisher T-L, Schisler JC, O'Connor WG, Rogers AB, Willis MS, et al. (2013) Сърдечно-метаболитни ефекти на ХИВ протеазни инхибитори (Lopinavir/Ritonavir). PLoS ONE 8 (9): e73347. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0073347

Редактор: Sudhiranjan Gupta, Тексас A&M, Отдел по кардиология, Съединени американски щати

Получено: 13 май 2013 г .; Прието: 18 юли 2013 г .; Публикувано: 30 септември 2013 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Южноафриканската национална изследователска фондация и Университета на Стеленбош (MFE), Регионалния съвет на Ла Реюнион и l'Europethe Jefferson (EB) и пилотна стипендия по академична медицина (MSW). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Вирусът на човешкия имунен дефицит (ХИВ) е заразил над 40 милиона индивида през последното десетилетие, като повече от 5 милиона живеят в Африка на юг от Сахара [1], [2]. Въпреки че високоактивната антиретровирусна терапия (HAART) повишава продължителността на живота и качеството на заразените лица [3], [4], все повече се набляга на HAART-медиираните метаболитни нарушения [5] и потенциалния риск от сърдечно-съдови заболявания (ССЗ) -термин.

Протеазните инхибитори (PI) формират неразделна част от HAART и страничните ефекти включват развитие на дислипидемия, т.е. по-голямо производство на плазмени триглицериди и липиди заедно с неблагоприятен холестеролен профил [6] - [8]. Заедно такива нарушения предизвикват възпаление, стресират миокарда (9) и потенциално могат да предскажат появата на инсулинова резистентност (IR) [10], [11] и сърдечна дисфункция (11). ИП също са свързани с повишен риск от миокарден инфаркт [13] и сърдечно-съдови аномалии [14], [15], с много промени, наподобяващи коронарна артериална болест [16]. Не е ясно дали метаболитните странични ефекти на PI са независимо и/или причинно-следствена връзка със сърдечно-съдови смущения. Освен това ефектите на PI върху сърцето в този контекст също са слабо разбрани. Следователно, новият фокус е да се идентифицират ключови метаболитни и транскрипционни пътища, които могат да медиират индуцирана от PI кардио-метаболитна патофизиология. Например, наскоро открихме, че плъховете, изложени на 8 седмично лечение с PI, показват сърдечна дисфункция [17]. Освен това, лекуваните с PI лица, заразени с ХИВ, показват повишено производство на реактивни кислородни видове (ROS) [18] - [20], което може да предизвика активирането на вредни сигнални пътища и пътища на клетъчна смърт [21].

Материали и методи

Животински модел.

Лопинавир/ритонавир (Kaletra TM, Abbott Laboratories, Abbot Park IL) се раздробява и разтваря в 1% разтвор на етанол (носител) при плазмена концентрация в стационарно състояние на човека (7,1 ± 2,9 µg/ml), стерилно се филтрира и инжектира в мини -осмотична помпа (Alzet, Купертино, Калифорния). Мъжки плъхове Wistar (180–220 g) получават или: фалшива операция (фалшива), носител или PI-съдържаща помпа за общо 8 седмици (n = 8 на група), както е описано по-рано [17]. Консумацията на храна се измерва чрез седмично претегляне на храната (в клетки) и се изразява като средна консумирана храна на плъх. Всички животни бяха третирани в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни на Националната академия на науките (публикация на NIH № 85–23, ревизирана през 1996 г.) и извършени с одобрението на Комитета по етика на животните от университета в Стеленбош (Юг Африка).

Изходна оценка на сърдечната функция.

След 8 седмици плъховете бяха евтаназирани с пентобарбитон-натрий (10 mg/kg, ip) и сърцата бързо изрязани, претеглени и поставени в ледено студен буфер на Krebs-Henseleit (KH) преди канюлиране върху перфузионна платформа на Лангендорф, както е описано по-горе [17] . Канюлацията и перфузията настъпиха в рамките на 2) след изваждане на фона и се нормализираха до β-актин или петно ​​на Понсо, за да се коригират вариациите в натоварването. Първични антитела (заек или мишка) са закупени от Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz CA) или Cell Signaling (Cell Signaling, Danvers MA), за да се използват при разреждане 1: 1000 със съответно вторично антитяло (анти-заешко или анти- -миши HRP-свързани антитела при разреждане 1: 4000).

Оценка на миокардния оксидативен стрес.

Активността на супероксиддисмутазата (SOD) (Enzo Life Sciences, Farmingdale NY) е измерена в митохондриални препарати (приготвени съгласно Boudina et al. [38]), следвайки инструкциите на производителя. Анализът на активността на каталазата се основава на свойствата на каталазния ензим да редуцира водородния пероксид (H2O2) в кислород (O2) и вода (H2O) [39]. Проведени са анализи на около 80 μg протеинов лизат в 25 mM Tris – HCl (рН 7,5). Заготовките бяха измерени при 240 nm непосредствено преди добавяне на 80 uL H2O2 (10 mM окончателно), за да започне реакцията. Каталазната активност се определя чрез измерване на намалението на абсорбцията на H2O2 при 240 nm. Разграждането на водородния пероксид е тип реакция от първи ред след концентрация на H2O2 и константата на скоростта K за цялостната реакция се дава от:

Всяко измерване се разглежда с 4 повторения и данните се изразяват като каталитична единица (U) на mg общ протеин. Карбонилирането на протеини се извършва на сърдечни тъкани, както е описано по-горе [40].

Определяне на активирането на неоксидативния път.

Накратко, събраните сърдечни тъкани се хомогенизират с модифициран ледено студен RIPA буфер, супернатантът се центрофугира два пъти при 13 000 g за 10 минути при 4 ° C, след което се съхранява при -80 ° C до по-нататъшна употреба. Използвахме Western blot анализ, за ​​да определим общата експресия на O-GlcNAc като маркер за активиране на HBP на миокарда и концентрации на метилглиоксал за оценка на активирането на AGE пътеката (OxiSelect ™ MG ELISA Kit; Cell Biolabs, Сан Диего, Калифорния). Производните на метилглиоксал се образуват от неензимната реакция на редуциращи въглехидрати като глюкоза и карбонилни съединения (глицералдехид) в реакцията на Maillard - продуктите от тази реакция се наричат ​​AGEs. Нивата на MG са изчислени от стандартната крива и са изразени като nmol на mg протеин. PKC анализът се провежда, използвайки метод, базиран на ELISA, както е описано подробно в ръководството за употреба на комплекта (Enzo Life Sciences, Farmingdale NY). PKC активността се определя от стандартната крива и се изразява като ng/min/mL.

D-сорбитолът, междинен продукт на полиолния път, беше измерен като индекс на активиране на пътя. Нивата на D-сорбитол се измерват, както е описано подробно в инструкциите на търговски получен комплект (BioVision К 631-100, Mountain View CA). Изчислихме концентрацията на сорбитол (С) на пробите, като използвахме количеството на пробата (nmol) от стандартната крива (Sa), използвания обем на пробата (μL) (Sv) и фактора на разреждане (D); C = Sa/Sv * D. Използвахме модифициран протокол (EC 2.2.1.1) от Sigma Aldrich (Сейнт Луис МО), за да определим транскетолазната активност като маркер на неокислителния клон на пентозофосфатния път (PPP). Накратко, ксилулоза 5-фосфат и рибулоза 5-фосфат се преобразуват чрез транскетолаза в присъствието на магнезиеви йони и тиамин пирофосфат в глицералдехид 3-фосфат и седохептулоза 7-фосфат. След това G 3-P се превръща допълнително от триосефосфат изомераза в дихидроксиацетон фосфат и с добавянето на β-NADH и α-глицерофосфат дехидрогеназа за получаване на а-глицерол фосфат и β-NAD, които се измерват спектрофотометрично при 340 nm. Този протокол е адаптиран от de la Haba et al. (1955) [41].

статистически анализи.

Данните са представени като средна стойност ± SEM и стойности, считани за значими, когато р 0,05). Въпреки това, лечението с PI повишава серумните нива на LDL-холестерол до 0,433 ± 0,021 срещу 0,216 ± 0,005 mM (фалшиво) (р 0,05) (Фиг. 1 E, F). В допълнение, общата консумирана храна при третирани с PI животни е значително по-висока от контролните групи; т.е. 894 ± 17,8 g срещу 707 ± 14,3 g (фалшиво) (p Фигура 1. Характеризиране на липидите в серума и тъканите (n = 8).

А) серумен FFA; Б) серумен LDL-холестерол; В) серумен TG; Г) серумен общ холестерол; Д) сърдечен общ холестерол; Е) сърдечен LDL-холестерол; Ж) сърдечен TG; и Н) сърдечен HDL-холестерол. * p Фигура 2. Характеристика на гена и хистологията (n = 8).

A) H & E оцветяване за различни тъкани след PI лечение; Б) Сърце; и В) регулиране на чернодробния ген; и D) експресия на ядрен SREBP протеин. ** p Таблица 1. Ефект на PI върху параметрите на сърдечната функция ex vivo на изходно ниво (n = 8).

След това оценихме ефектите от лечението с PI върху сърдечната UPS система и нашите данни показват значително намалени химотрипсиноподобни и каспазаподобни, но не и трипсиноподобни протеазомни дейности (Фиг. 3А). Успоредно с това, глобалното убиквитиниране на общите протеини значително се увеличи с приложението на PI (Фигура 3В). Тъй като по-ранната ни работа посочи промяна в нивата на SERCA-2a [17], ние се опитахме да получим допълнителна представа относно PI-медиираната контрактилна дисфункция, маркери, регулиращи този йонен канал, както и маркер за електрическа проводимост. Тук експресията на миокарда на протеина на междинната връзка коннексин 43 (маркер за електрическа проводимост) и pPLB (регулатор SERCA-2a) се увеличава с PI лечение (Фиг. 3C, D).

A) LLVY (активност, подобна на химотрипсин), LSTR (активност, подобна на трипсин) и LLE (активност, подобна на каспаза) на протеазомата; Б) Общо протеиново убиквитиниране; В) Connexin 43; и Г) фосфорилиран PLB. * p Фигура 4. Експресия на протеин на калциев път в отговор на хронична PI терапия (n = 6-8).

А) Калмодулин; Б) Калциневрин; В) pCaMKII; и Г) NFAT3. * p Фигура 5. Нива на миокарден пептид на транскрипционни регулатори на сърдечна хипертрофия и митохондриална биогенеза с 8 седмична PI терапия (n = 6–8).

А) PGC-1α; B) NRF-1; и С) mtTFA. *** p Фигура 6. Профил на оксидативен стрес на миокарда (n = 8).

А) Митохондриална SOD активност; Б) Протеиново карбонилиране; и В) активност на миокардната каталаза. *** p Фигура 7. Профил на сърдечните неоксидативни метаболитни пътища (n = 8).