Резюме

Въведение

Безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) е чернодробно метаболитно нарушение, което не включва прием на алкохол. Важното е, че през годините нивата на затлъстяване са се увеличили поради промени в начина на живот и хранителните навици и в резултат NAFLD се превърна в честа причина за хронични чернодробни заболявания в много страни [1]. NAFLD включва широк спектър от чернодробни заболявания от проста стеатоза до неалкохолен стеатохепатит (NASH), фиброза и цироза и в крайна сметка хепатоцелуларен карцином и чернодробна недостатъчност [2]. Обикновената стеатоза обикновено не се счита за сериозно състояние. NASH обаче може да се развие в цироза или рак на черния дроб, което в крайна сметка може да бъде фатално [3]. Въпреки че са проведени много изследвания, патологичните механизми на NAFLD остават да бъдат изяснени и терапевтичните лекарства трябва да бъдат разработени. Широкият спектър на NAFLD затруднява идентифицирането на точен стадий на заболяването, а характеристиките на много бавно прогресиращите заболявания са трудни за определяне в клиничните изследвания [4]. Следователно, животински модел, рекапитулиращ човешки NAFLD, може да предостави важна информация за определяне на патогенезата на заболяването и за изследване на терапевтичните ефекти на различни лекарства [5].

Животинските модели на NAFLD до голяма степен се класифицират като генетично инженерни и хранителни (диетични) модели според етиологията. Като цяло, диетичната индукция на NAFLD при експериментални животни е предпочитаният метод за възпроизвеждане на състояния, наблюдавани при хора, като метаболитен синдром, докато генетично инженерните животни се използват за подробни механистични изследвания [6]. Тъй като ICR мишките имат ниско ниво на агресия и силна способност за разплод, те се използват в цял свят за изследване на много заболявания в различни области като онкология, инфекции и фармакология [7].

Материали и методи

Животни и лечение

Осемседмични мъжки ICR мишки са получени от три различни източника. Korl: ICR мишките бяха любезно предоставени от Департамента по лабораторни и животински ресурси към NIFDS (Cheongju, Корея). Останалите две групи ICR мишки са закупени от доставчици в САЩ (A: ICR) и Япония (B: ICR). Всички експерименти с животни са одобрени от Комитета за експерименти и използване на животните в Националния университет в Пусан (PNU-2018-1994). Основните условия като обкръжаващата среда и диетата са описани по-горе [16]. Мишките бяха аклиматизирани до 22 ± 2 ° C и влажност 55 ± 5% в диетичната стая с 12-часов цикъл светлина/тъмнина в продължение на 1 седмица преди употреба. Те бяха разделени на случаен принцип в две групи, хранени с различни диети в продължение на 6 седмици: нормална диета (контролна) или HFMCD, съставена от 60 kcal% мазнини, без добавен холин и 0,1% метионин. Черният дроб и бъбреците са взети проби на 1 и 6 седмици.

Биохимичен анализ на кръвта

Взети са кръвни проби от коремната аорта на всяка мишка; серумите бяха разделени с помощта на BD Microtainer Blood Collection Tube (BD Life Sciences, Franklin Lakes, NJ, USA) и използвани за измерване на активността на аланин аминотрансфераза (ALT), аспартат аминотрансфераза (AST) и лактат дехидрогеназа (LDH). ALT и AST се измерват с помощта на протоколите на Reitman и Frankel [17], а LDH се измерва с помощта на търговски комплект, закупен от Dogen (Сеул, Корея). Резултатите се определят количествено със спектрофотометър, използвайки Multiskan GO четец (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA).

Хистопатологичен анализ

Левият страничен лоб на черния дроб беше нарязан и фиксиран с 4% параформалдехид. Тъканите бяха вградени в парафин и 5-μm участък беше оцветен с хематоксилин и еозин (H&E), за да се разграничат ядрата и цитоплазмата.

Пречистване на РНК и количествена RT-PCR

Количествената RT-PCR беше определена, както беше съобщено по-рано [16]. Обща РНК беше изолирана от чернодробния лизат, използвайки комплекта Direct-zol RNA (Zymo Research, Orange, CA, USA). cDNA се синтезира с iScript cDNA Synthesis system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Количествената RT-PCR беше извършена с помощта на сместа SensiFAST SYBR qPCR (Bioline, Лондон, Великобритания) съгласно протокола на производителя. Стойностите на генната експресия бяха нормализирани до тези на GAPDH. Последователностите на грундовете са дадени в Таблица 1.

Статистически анализ

Всички данни са изразени като средно ± стандартно отклонение (SD). Статистическата значимост беше определена с помощта на Student’s т-тест и стр

Резултати

Ефекти от диетата HFMCD върху изменението на телесното тегло

Диетите с високо съдържание на мазнини причиняват затлъстяване и инсулинова резистентност, но са необходими 30 седмици за установяване на NASH [14]. MCD диетата често се използва за индуциране на NASH чрез индуциране на чернодробна стеатоза и възпаление в рамките на 4 седмици, но се характеризира с тежка загуба на тегло [13]. Поради това се опитахме да индуцираме NAFLD/NASH, като използваме диета HFMCD. Промените в телесното тегло в продължение на 6 седмици не показват значителни разлики между контролните и HFMCD-хранени мишки (фиг. 1).

чернодробно

Ефект на HFMCD върху промените в телесното тегло на Korl: ICR (а), A: ICR (б) и B: ICR (° С) мишки. ICR мишките бяха хранени с контролна (CON) или диета с дефицит на L-метионин и холин с високо съдържание на мазнини (HFMCD), съставена от 60 kcal% мазнини, без добавен холин и 0,1% метионин в продължение на 6 седмици. н = 8 на диета

Ефекти от диетата HFMCD върху промените в относителните тегла на черния дроб и бъбреците

За да изследваме ефекта от продължителността на храненето, взехме проби на 1 и 6 седмици след добавяне на HFMCD. Относителното тегло на черния дроб се увеличава постепенно (фиг. 2а) и на 6 седмици показва приблизително двукратно увеличение на мишки, хранени с HFMCD, в сравнение с контролните мишки, хранени с диета. Относителното тегло на бъбреците остава непроменено по време на експеримента (фиг. 2б). Резултатите са сходни при всички мишки, независимо от техния произход.

Ефект на HFMCD диета върху ALT, AST и LDH активности в серума

Серумните активности на ALT (фиг. 3а), AST (фиг. 3b) и LDH (фиг. 3в), които са показатели за чернодробно увреждане, са значително увеличени от диетата HFMCD на 1 седмица и остават повишени на 6 седмици.

Ефекти от диетата HFMCD върху хистопатологичните промени в черния дроб

Изследвахме хистопатологични промени в черния дроб, за да установим дали HFMCD индуцира прогресията на NAFLD по начин, зависим от времето. На 1 седмица NAFLD индуцира както микро-, така и макровезикули, отразявайки натрупването на липиди в черния дроб; този ефект е бил по-тежък на 6 седмици (фиг. 4). Макровезикулите заемат по-голямата част от черния дроб, а инфилтрацията на неутрофили, което е възпалителна реакция, също се наблюдава в черния дроб на мишки, хранени с HFMCD на 6 седмици. Тези резултати предполагат, че HFMCD индуцира прогресия от стеатоза към NASH по времезависим начин в рамките на 6 седмици. Значимостта на разликите между мишки от различен произход не е изследвана.

Ефект на диетата HFMCD за 1 и 6 седмици върху натрупването на липиди в черния дроб на мишки от три различни източника. Чернодробните тъкани се оцветяват с H&E

Индукция на възпалителен отговор в черния дроб чрез диета HFMCD

MCD диетата увеличава секрецията на възпалителни цитокини и по този начин индуцира възпаление на черния дроб, което води до NASH [18]. За да потвърдим индукцията на възпалителен отговор от HFMCD, предложен от неутрофилна инфилтрация, ние изследвахме експресията на иРНК на TNF-α, IL-6 и IL-1β в черния дроб. И трите цитокини показват зависими от времето повишения и са драматично индуцирани от HFMCD на 6 седмици след това (Фиг. 5). Нивата на TNF-α (фиг. 5а) и IL-6 (фиг. 5Ь) транскрипти са били повишени приблизително 15 пъти, а тези на IL-1β (фиг. 5в) са били увеличени повече от 20 пъти на 6 седмици след прием на HFMCD.

Експресия на фиброзни маркери в черния дроб чрез диета HFMCD

Фиброзата се счита за по-напреднал стадий на NAFLD и се чудехме дали приемът на HFMCD в продължение на 6 седмици би повлиял на чернодробната фиброгенеза при ICR мишки. Нивото на mRNA на α-SMA и TGFβ1, маркери за активиране на чернодробни звездни клетки и колаген 1A1 (Col1a1), един от компонентите на ECM, бяха значително индуцирани от HFMCD на 6 седмици след това (Фиг. 6). Нивата на транскрипт на α-SMA (фиг. 6а), TGFβ1 (фиг. 6б) и Col1a1 (фиг. 6в) са били повишени приблизително 8-, 15- и 3 пъти съответно на 6 седмици след приема на HFMCD.

Дискусия

NAFLD се превърна в най-честата причина за хронични чернодробни заболявания в световен мащаб, тъй като честотата на затлъстяване, диабет и метаболитен синдром се увеличи [19]. NAFLD включва клинико-патологичен спектър от мастни чернодробни заболявания, които се появяват при липса на консумация на алкохол [20]. Първоначалният симптом е чернодробната стеатоза, която се счита за относително доброкачествено чернодробно увреждане. Ако обаче увреждането на черния дроб се влоши, прогресията към NASH става по-бърза и смъртността, свързана с чернодробни заболявания, се увеличава [21]. NASH се характеризира с наличие на стеатоза, възпаление и хепатоцелуларна смърт [22]. Има все повече доказателства, че NASH може да причини прогресивна фиброза, цироза и впоследствие рак на черния дроб [23].

MCD диетата отдавна се използва за изследване на NAFLD. Диетите, хранени с MCD, показват значително натрупване на липиди в черния дроб от 2 до 4 седмици, последвано от възпаление и прогресия на фиброзата [24]. MCD диетата намалява секрецията на VLDL, увеличава приема на мастни киселини, индуцира възпалителна сигнализация, индуцира ендоплазмен стрес и предизвиква липидна пероксидация [25]. Той има предимството да индуцира NAFLD за кратък период от време, но недостатъкът му е сериозна загуба на тегло, което не е често срещан симптом при пациенти с NAFLD при хора [26]. Поради това се предлага диета с HFMCD, която е комбинация от диета с високо съдържание на мазнини и MCD, за да възпроизведе патологичните симптоми на NAFLD [6]. Важно е, че този модел на диета имитира човешко заболяване, включително много от биохимичните и хистопатологичните характеристики на прогресията на NAFLD [27]. Към днешна дата някои групи съобщават за разлики между инбредни щамове мишки по отношение на тяхната податливост към индуцирана от диетата NAFLD и NASH [6, 28,29,30,31]. По-специално, диетата HFMCD индуцира по-тежък фенотип на NASH с фиброза при мишки C57BL/6 в сравнение с мишки A/J [6], а продължителното излагане на HFD доведе до NASH при мишки C57BL/6 J, но не и при A/J мишки [31].

Заключения

Това проучване предполага, че моделът HFMCD може да бъде друга възможност за преодоляване на недостатъка на NAFLD модела, предизвикан от MCD или диета с високо съдържание на мазнини. Също така открихме, че отговорите на мишките Korl: ICR, установени от NIFDS в Корея, са подобни на тези на мишките ICR от други източници, което предполага, че това е полезен ресурс за изследване на патогенезата на индуцирана от диетата NAFLD.

Наличност на данни и материали

Наборите от данни, използвани и/или анализирани в това проучване, са достъпни от съответния автор при разумна заявка.