Тази статия има корекция. Моля виж:

Резюме

Поведението сън-будност се контролира от широк спектър от невронални популации в мозъка на бозайниците. Въпреки че се препоръчва зоната на вентралния среден мозък/мост (VMP) да участва в регулирането на съня и събуждането, невронните механизми остават неясни. Тук открихме, че неспецифичната клетъчна аблация или селективна аблация на GABAergic неврони чрез експресиране на дифтериен токсин фрагмент А във VMP при мъжки мишки предизвиква голямо увеличение на будността, което продължава най-малко 4 седмици. За разлика от тях, селективната аблация на допаминергичните неврони във VMP има малък ефект върху будността. Хемогенетичното инхибиране на VMP GABAergic неврони също значително повишава будността. Ефектът, стимулиращ събуждането, на абсорбирането или инхибирането на VMP GABAergic неврон се отслабва в различна степен чрез приложението на антагонисти на допамин D1 или D2/3 рецептора и се премахва чрез приложението и на двата антагониста заедно. За разлика от тях, хемогенетичното активиране на VMP GABAergic неврони много силно увеличава бавно-вълнения сън и намалява будността. Тези открития предполагат, че VMP GABAergic невроните регулират допаминергичните действия в поведението сън-будност на мишки.

сънят

ЗНАЧЕНИЕ ЗА ЗНАЧЕНИЕ Понастоящем разбирането за невроналните механизми и популациите, които регулират поведението сън-събуждане, е непълно. Тук идентифицирахме зона на GABAergic вентрален среден мозък/понс, която е необходима за контролиране на дневното количество сън и будност при мишки. Също така открихме, че тези инхибиторни неврони контролират будността чрез потискане на допаминергичните системи. Изненадващо, активирането на тези неврони силно индуцира бавен вълнен сън, докато потиска будността. Нашето проучване разкрива нов мозъчен механизъм, критичен за регулирането на съня и събуждането.

  • AAV
  • възбуда
  • УМРАЗ
  • ЕЕГ
  • невронни вериги
  • REM сън

Въведение

Една потенциална функция на съня е да пести енергия чрез налагане на бездействие, когато активността не е от полза (Siegel, 2009). И обратно, когато различните екологични изисквания благоприятстват будността, животните може да имат способността да се откажат от съня. Механизмите на веригата, лежащи в основата на контрола на будността, за да се адаптира количеството сън на животното към поведението му, са до голяма степен неизвестни.

Наскоро идентифицирахме невроните с непряк път в ядрото на акумулацията като контролиращи съня неврони (Oishi et al., 2017b). Nucleus accumbens се инервира от невроните на вентралната тегментална зона (VTA) във вентралната част на средния мозък (Taylor et al., 2014; Oishi and Lazarus, 2017). Въпреки че ние и други съобщавахме, че активирането на VTA допаминергичните неврони силно индуцира събуждане (Eban-Rothschild et al., 2016; Taylor et al., 2016; Oishi et al., 2017a), ролята на тази зона на средния мозък в съня - регулирането на събуждането остава неясно, тъй като констатациите са противоречиви. При плъховете невротоксичните лезии на клетките в тази област с хипокретин-2-сапорин нямат ефект върху поведението сън-будност (Gerashchenko et al., 2006). При котките електролитните лезии на вентралната област на средния мозък, включително VTA, не оказват значително влияние върху поведението сън-будност (Jones et al., 1973), докато N-метил-d-аспартатните лезии на клетки в зона, съдържаща VTA произвеждат безсъние (Lai et al., 1999).

В настоящото изследване използвахме аблационна техника, базирана на вирусна експресия на дифтериен токсинов фрагмент А (DTA) и установихме, че неспецифични или специфични за GABAергичен неврон аблации в вентралната медиална зона на средния мозък/понс (VMP) на кръстовището на вентралната медиалният среден мозък и моста до голяма степен повишават будността при мишки. Повишената будност се наблюдава и след хемогенетично инхибиране на VMP GABAergic невроните. Използвайки фармакологични инструменти, ние допълнително демонстрирахме, че този възбуден ефект се медиира от допаминергичните системи. Тези открития показват, че VMP GABAergic клетките са от решаващо значение за контрола на поведението сън-будност.

Материали и методи

Мишки и химикали.

Използвахме следните линии на мишката: C57BL/6J див тип (WT, Charles River Laboratories), допаминов транспортер (DAT) -Cre (Bäckman et al., 2006) (The Jackson Laboratory 006660) и везикуларен GABA транспортер (VGAT) -Cre (Vong et al., 2011) (любезно предоставено от д-р Брадфорд Лоуъл, Медицинско училище в Харвард). Мъжките мишки (8–20 седмици, 25–35 g) бяха използвани за поведенчески изследвания и настанени в изолирани звукоизолирани камери за запис, поддържани при температура на околната среда 23 ± 0,5 ° C с 55 ± 3% влажност на 12 часа светлина/тъмен цикъл (светлините светват в 8:00) и осигурени храна и вода ad libitum. Всички експерименти бяха проведени в съответствие с Комитета за грижа за животните към университета в Цукуба и бяха положени всички усилия да се намали броят на използваните животни, както и всяка болка или дискомфорт.

Клозапин-N-оксид (CNO, Millipore-Sigma), селективният D1 рецепторен антагонист SCH23390 (Millipore-Sigma), селективният D2/D3 рецепторен антагонист раклоприд (Millipore-Sigma) и хистамин H1 рецепторен антагонист кетотифен (Tokyo Chemical) разтворени във физиологичен разтвор.

Плазмиди и аденоасоциирани вирусни вектори (AAV).

За да се генерира pAAV-CMV-FLEX-DTA плазмид, FLEX-DTA касета (вж. Фиг. 1А) е синтезирана от Eurofins Genomics K.K. и се вмъква между ClaI и BamHI рестрикционните сайтове във pAAV-MCS вектор (Stratagene). За да се генерира pAAV-CMV-FLEX-hrGFP плазмид, DTA фрагментът между AscI и NheI рестрикционните сайтове в pAAV-CMV-FLEX-DTA беше заменен с hrGFP кодираща последователност. Плазмидите pAAV-hSyn-FLEX-hM4Di-mCherry и pAAV-hSyn-FLEX-hM3Dq-mCherry (Krashes et al., 2011) бяха любезно предоставени от д-р Bryan Roth (Медицински факултет на Университета на Северна Каролина, Chapel Hill, NC) ). Плазмидите, генерирани в това изследване, ще бъдат депозирани в Addgene.

pAAV-CMV-FLEX-DTA, pAAV-CMV-FLEX-hrGFP, pAAV-CMV-Cre (Lazarus et al., 2011), pAAV-hSyn-FLEX-hM4Di-mCherry или pAAV-hSyn-FLEX-hM3Dq-mCherry са опаковани в AAV на серотип rh10, като се използват 293А клетки, както е описано по-горе (Kaur et al., 2017; Oishi et al., 2017a, b).

Хирургия.

За мозъчни микроинжекции мишки, анестезирани с пентобарбитал (60 mg kg -1, ip), се инжектират двустранно във VMP (3,4 mm отзад и 0,2 mm странично от брегма, 4,4 mm под твърдата мозъчна обвивка) с 60 nl на инжекция AAV с помощта на стъкло микропипета и инжекторна система за въздушно налягане. За генериране на мишки с неселективна аблация на клетъчен тип, WT мишките се инжектират със смес (1: 1) от AAV-FLEX-DTA (8,6 × 10 10 частици ml -1) и AAV-Cre (1,5 × 10 11 частици ml - 1) или AAV-FLEX-DTA самостоятелно. За генериране на мишки с допаминергична или GABAergic невронна аблация, DAT-Cre мишки или VGAT-Cre мишки, съответно, се инжектират с AAV-FLEX-DTA или AAV-FLEX-hrGFP (1,5 × 10 11 частици ml -1). За хемогенетичните експерименти на мишките VGAT-Cre се инжектира AAV-FLEX-hM4Di-mCherry (1,1 × 10 11 частици ml -1) или AAV-FLEX-hM3Dq-mCherry (1,1 × 10 11 частици ml -1).

Мишките също бяха имплантирани хронично с електроенцефалографски (EEG) и електромиографски (EMG) електроди за полисомнография, както е описано по-рано (Oishi et al., 2016). Накратко, имплантът включва два винта от неръждаема стомана, служещи като ЕЕГ електроди, и два изолирани, покрити с тефлон сребърни проводници са поставени двустранно в трапецовидните мускули, за да служат като EMG електроди. Електродите бяха фиксирани към черепа със зъбен акрил.

Записи на ЕЕГ/ЕМГ.

След като позволиха 1-2 седмици за следоперативно възстановяване и експресия на трансгени, мишките бяха свързани с EEG/EMG записващи кабели. ЕЕГ/ЕМГ сигналите бяха усилени и филтрирани (ЕЕГ: 0,5–64 Hz, EMG: 16–64 Hz), дигитализирани със скорост на вземане на проби от 128 Hz и записани с помощта на софтуера SLEEPSIGN (Kissei Comtec). Състоянията на бдителност се оценяват офлайн, като характеризират 10 s епохи в три етапа: (1) буден, (2) бавен вълнен сън (SWS) и (3) бърз сън с движение на очите (REMS) съгласно стандартните критерии (Oishi et al., 2016).

Фармакологични и хемогенетични експерименти.

След изходни записи в продължение на 24 часа, на VGAT-Cre DTA/VMP мишки се прилага физиологичен разтвор, 0,03 mg kg -1 SCH23390, 2 mg kg -1 раклоприд или 10 mg kg -1 кетотифен в 10:00. Всяка мишка получава всички комбинации от антагонисти на допаминовите рецептори в случаен ред с поне 3 d интервали между приема на лекарства. Отделна миша група получи кетотифен. Дозите на лекарствата са избрани въз основа на предишни проучвания (Qu et al., 2008; Unno et al., 2012; Oishi et al., 2017a). За хемогенетично инхибиране, мишките VGAT-Cre M4/VMP се инжектират интраперитонеално с физиологичен разтвор или 3 mg kg -1 CNO в 10:00 в 2 последователни дни. За хемогенетично активиране, всяка мишка VGAT-Cre M3/VMP получава интраперитонеално физиологичен разтвор или различни дози (0,3, 0,9 и 2,7 mg kg -1) от CNO в 20:00 часа с интервали от поне 3 дни между приема на лекарства.

Хистология.

Под дълбока анестезия с предозиране на хлоралхидрат (500 mg kg -1, i.p.), животните се инфузират интракардиално с физиологичен разтвор, последван от неутрален буфериран 10% формалин. След това мозъците се поставят в 20% захароза за една нощ при 4 ° C, за да се намали артефактът на замръзване. Мозъците бяха разделени на 40 μm върху замразяващ микротом.

За имунохистохимия срезовете бяха инкубирани в 0,3% водороден прекис и след това през нощта със заешки анти-DsRed (1: 10 000, Clontech, каталог # 632496, RRID: AB_10013483), миши анти-NeuN (1: 2000, Millipore, каталог # MAB377, RRID: AB_2298772) или заешка анти-тирозин хидроксилаза (TH; 1: 20 000, Millipore, каталог № AB152, RRID: AB_390204). Секциите бяха инкубирани в продължение на 2 часа в биотинилирани антитела (1: 1000, Jackson ImmunoResearch Laboratories) и третирани с авидин-биотин комплекс (1: 1000; Vectastain ABC Elite kit, Vector Laboratories) за 1 h. Имунореактивните клетки се визуализират чрез реакция с 3,3′-диаминобензидин и 0,01% водороден пероксид.

За in situ хибридизация генерирахме 918-bp белязан с дигоксигенин рибопроба за VGAT мРНК чрез PCR амплификация (праймери: напред, gcatgttcgtgctgggcctacc; обратна, cagcgcagcgtcagcccccag конюгирана с T7 промотор, последван от геномна ДНК на мишка опашка в геномна ДНК като vitro транскрипция. След това срезовете бяха инкубирани с 1 μg ml -1 концентрация на сондата VGAT в 5 х натриев цитратен буфер, съдържащ 50% формамид при 50 ° С в продължение на една нощ, измити в 1 разтвор на физиологичен разтвор на натриев цитрат при 50 ° С, инкубирани с конюгирана алкална фосфатаза анти-дигоксигениново антитяло (1: 500, Roche) през нощта и се визуализира чрез реакция с 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат/нитро син тетразолий (BCIP/NBT, Millipore-Sigma).

За двойно маркиране на c-Fos и mCherry, ние имунооцветихме c-Fos със заешко анти-c-Fos антитяло (1: 2000, Millipore, каталог # ABE457, RRID: AB_2631318), конюгирано с пероксидаза анти заешко антитяло (1: 250, Jackson ImmunoResearch Laboratories) и конюгиран с тирамид флуоресцеин (PerkinElmer). mCherry-положителни клетки бяха идентифицирани чрез естествената червена флуоресценция на mCherry. Изображенията бяха анализирани с конфокален лазерен сканиращ микроскоп LSM800 (Carl Zeiss).

За количествен хистологичен анализ сме преброили клетки, положителни за TH, VGAT иРНК, c-Fos или mCherry, като използваме кутия за броене, поставена двустранно във VMP. Поставихме кутия с размери 500 × 650 μm с вентрален медиален ръб в центъра на интерпедункулярното ядро ​​и медиална граница по средната линия 3,8 mm отзад на брегмата. Предната и задната координати са получени от мозъчния атлас на мишките Paxinos и Franklin (Paxinos и Franklin, 2001). Броят на клетките се коригира с помощта на корекционния фактор Abercrombie (Guillery, 2002).

Електрофизиология.
Експериментален дизайн и статистически анализ.

За поведенчески експерименти броят на използваните мишки е избран въз основа на очакваните вариации между животните и вариабилността на AAV микроинжекциите.

Дефицитът на допаминергичен неврон на VMP има слаб или никакъв ефект върху будността

Дефицитът на VMP GABAergic неврон увеличава будността при мишки

Допаминът медиира повишеното будност при мишки с дефицит на VMP GABAergic неврон

Антагонистите на допаминовите рецептори потискат будността при мишки с липса на GABAergic неврони във VMP. Общо количество будност за 6 часа във VGAT-Cre DTA/VMP (A, ° С) или VGAT-Cre hrGFP/VMP мишки (Б., д) лекувани с антагонисти на допаминовите рецептори (SCH23390 и/или раклоприд; A, Б.) или антагонист на хистамин Н1 рецептор кетотифен (° С, д). Данните са представени като средната стойност ± SEM (n = 5–8).

Хемогенетичното инхибиране на VMP GABAergic неврони увеличава будността