Резюме

Заден план

Загуба на първични реснички често се наблюдава в туморните клетки, което предполага, че отсъствието на тази органела може да стимулира туморогенезата чрез анормална трансдукция на сигнала, невъзможността за излизане от клетъчния цикъл и насърчаване на инвазията на туморни клетки. Първичната загуба на реснички също се случва в клетките на езофагеален плоскоклетъчен карцином (ESCC), но молекулните механизми, които обясняват как ESCC клетките губят първични реснички, остават слабо разбрани.

Методи

Инхибиране на експресията на Prdx1 в клетките на ESCC за откриване на регулираните нагоре гени, свързани с регенерацията на ресничките, и гени, регулирани надолу, свързани с разглобяването на реснички чрез генния чип. И бяха проведени експерименти с мишки и клетки, за да се потвърди ролята на сигналната ос HEF1-Aurora A-HDAC6 в ESCC.

Резултати

В това проучване открихме, че заглушаването на пероксиредоксин 1 (Prdx1) възстановява образуването на първични реснички, а свръхекспресирането на Prdx1 предизвиква първична загуба на реснички в ESCC клетките. Също така показахме, че експресията на Prdx1 регулира действието на сигналната ос HEF1-Aurora A-HDAC6 за насърчаване на разглобяването на първични реснички, а потискането на Prdx1 води до намалено образуване на тумор и обем на туморна маса in vivo.

Заключения

Тези резултати предполагат, че Prdx1 е нов регулатор на образуването на първични реснички в ESCC клетки.

Заден план

Първичният ресничест е подобна на антена органела, присъстваща на повърхността на повечето видове бозайници, с функция за трансдукция на извънклетъчен сигнал, която регулира растежа и развитието на клетките. Разглобяването на ресничките е тясно свързано с прогресирането на клетъчния цикъл и външната трансдукция на сигнала [1,2,3]. Разглобяването на реснички се случва, когато клетките се размножават и след това се извършва възстановяване след завършване на митозата [4]. Структурните или функционални аномалии на ресничките са свързани с много генетични заболявания, които се наричат ​​общо цилиопатии [5, 6]. Последните проучвания показват, че ресничките са тясно свързани с туморогенезата [7,8,9], а първичните реснички се разглобяват или губят в много туморни тъкани, включително плоскоклетъчен карцином на хранопровода (ESCC) [3, 10], рак на дебелото черво [11], рак на гърдата [12], чернодробен карцином [13], холангиокарцином [14] и рак на щитовидната жлеза [15]. Това предполага, че инхибирането на разглобяването или загубата на реснички в туморните клетки или насърчаването на регенерацията на ресничките може да инхибира пролиферацията и инвазията на туморни клетки.

ESCC е основният хистологичен подтип на езофагеален карцином. Последните проучвания показват, че 456 000 души са засегнати от карцином на хранопровода всяка година, от които плоскоклетъчният карцином на хранопровода представлява около 90% [16, 17]. ESCC е един от най-агресивните тумори в света, с петгодишна преживяемост, която е по-малка от 20% [18, 19]. Prdx1 е антиоксидантен протеин, който е широко експресиран в еукариотните клетки, предпазва клетките от увреждане на ROS [20] и регулира трансдукцията на клетъчния сигнал, като контролира клетъчната пролиферация и активността на H2O2. Съобщава се за анормална експресия на Prdx1 за много видове тумори [21, 22]. Няколко проучвания показват, че Prdx1 е силно експресиран в ESCC и Prdx1 е тясно свързан с разглобяването на първични реснички в тумори [23]. По този начин Prdx1 и първичните реснички могат да играят важна роля в развитието на ESCC, правейки Prdx1 вълнуваща потенциална цел за лечение на тумори. Въпреки това, подробният молекулярен механизъм, чрез който Prdx1 регулира разглобяването на ресничките в ESCC, остава неясен.

Нашите предишни изследвания демонстрираха, че запазеният в еволюция Prdx1 участва в регулирането на разглобяването на ресничките и намалява активността на Aurora A, маркер протеин на дезагрегация на реснички [3, 10]. В това проучване разширихме тази работа и установихме, че инхибирането на експресията на Prdx1 в ESCC клетките значително регулира гените, свързани с регенерацията на ресничките, и регулираните надолу гени, свързани с разглобяването на ресничките. Бяха проведени експерименти с клетки и животни и демонстрирано, че Prdx1 играе регулаторна роля в ключовата ос на разглобяването на ресничките, NEDD9 (HEF1) -Aurora A-HDAC6, и влияе върху туморогенността и инвазивността на ESCC клетките. Като цяло, нашите резултати показват, че Prdx1 допринася за разглобяването на първични реснички, като контролира сигналната ос NEDD9-Aurora A-HDAC6 в ESCC.

Методи

Клетъчни щамове и животни

Клетъчната линия на човешкия плоскоклетъчен карцином на езофагея EC9706 е получена от Държавната ключова лаборатория по молекулярна онкология, Китайска академия по медицински науки. Експерименталните клетки бяха разделени на седем групи, нормални EC9706 клетки, EC9706 клетки, трансфектирани с shPrdx1 лентивирус (shPrdx1), EC9706 клетки, трансфектирани с отрицателен контрол лентивирус (shControl), EC9706 клетки, трансфектирани с OE-Prdx1 лентивирус (OE-Prdx1), EC9706 трансфектирани със съответния отрицателен контролен лентивирус (OE-Control), EC9706 клетки, третирани с Tripolin A (EC9706 + Tripolin A), и EC9706 клетки, трансфектирани с OE-Prdx1 лентивирус и третирани с Tripolin A (OE-Prdx1 + Tripolin A). Здрави мъжки голи мишки BALB/c (4 седмици, н = 20, 10 във всяка група) са предоставени от Центъра за животни към Китайската академия на науките (Шанхай, Китай). Всички животни са отглеждани и лекувани в съответствие с насоки, разработени от Ръководството на Националния институт по здравеопазване за грижи и използване на лабораторни животни (NIH Publications No. 8023, ревизиран 1978 г.). Мишките бяха настанени при строго контролирани условия на околната среда SPF и мишките бяха умъртвени чрез вдишване на CO2.

Придобиване на лентивирус

Prdx1 интерфериращият и отрицателен контролен лентивирусен плазмид са конструирани чрез вмъкване на целевата последователност (shPrdx1: TGTCTGACTACAAAGGAAA, shControl: TTCTCCGAACGTGTCACGT) в сайтовете за намаляване на ензимните рестрикции на Age I/EcoR I на вектора на GV112-Lentivirus според предишните резултати. Свръхекспресираният Prdx1 (номер на присъединяване: NM_001202431) и контролният плазмид са конструирани чрез вмъкване на целевата последователност в сайтовете за рязане на рестрикционния ензим Age I/BamHI на вектора GV287-Lentivirus. Плазмидните вектори са получени от Genechem Co. Ltd. (Шанхай, Китай). Синтезът на целевата генна последователност, установяването на плазмидния носител и лентивирусната опаковка бяха извършени, както е описано по-рано [3].

Клетъчна култура и трансфекция на лентивирус

Клетките EC9706 се култивират в среда RPMI-1640 (Gibco), съдържаща 10% фетален говежди серум (FBS, Gibco) във влажна атмосфера от 5% CO2 при 37 ° C. Клетките EC9706 (MOI = 100) са заразени с shPrdx1 лентивирус (1 × 10 9 TU/ml) или свръхекспресирания лентивирус Prdx1 (1 × 10 8 TU/ml), за да намалят или увеличат нивата на Prdx1. Съответният лентивирус с отрицателна контрола беше трансфектиран по подобен начин в клетките. Процедурата беше следната. EC9706 клетки се инокулират в 6-ямкова микроплака с плътност 1 х 105/ямка. След това към всяка ямка се добавя 1 ml хранителна среда без антибиотици, когато клетките нарастват до 30% сливане. След това се добавят 5 mg/ml полибрен и лентивирусът и се култивират в продължение на 12 часа при 37 ° С, последвано от добавяне на 2 ml прясна хранителна среда. Експресията на GFP флуоресцентен протеин беше измерена като индикатор за ефективността на трансфекцията на лентивирус, използвайки инвертиран флуоресцентен микроскоп. Клетките се събират на 72 h за по-нататъшни експерименти.

Откриване на генни чипове

Откриването на генни чипове се използва за откриване на промените в генните и сигналните пътища в ESCC клетките след намеса Prdx1. Общата РНК на контролните EC9706 клетки и клетки, в които е инхибиран Prdx1, бяха изолирани с помощта на реагента Trizol. Извлечените проби от обща РНК бяха подложени на тестване на качеството с NanoDrop 2000 и Agilent Bioanalyzer 2100. След това квалифицираните проби бяха приложени към чип с профил на експресия на човешки ген (тип чип: GeneChip primeview human, номер: 901838), разработен от Affymetrix. Хибридизацията, измиването на генния чип, сканирането и анализът на данните бяха завършени от Genechem Co. Ltd. (Шанхай, Китай).

Образуване на тумор при голи мишки

Отрицателни контролни EC9706 клетки във фаза на логаритмичен растеж и EC9706 клетки с инхибирани нива на Prdx1 се приготвят като клетъчни суспензии и се инжектират подкожно в дясната аксилара на голи мишки (2 × 10 7/ml, 200 μl за всяка). Телесното тегло и обемът на тумора на всяка гола мишка се измерват два пъти седмично. Всяка гола мишка беше умъртвена под анестезия на 23 d и мишките бяха поставени в устройство за изобразяване на живо (IVIS® Lumina III) за откриване на луциферазна луминесценция и туморът беше отстранен, претеглен, фотографиран и консервиран, след като мишката беше жертвана.

Откриване на имунофлуоресценция на клетъчните реснички

За да се индуцира образуването на клетъчни реснички, клетките се инокулират в 24-ямкова плака. Когато плътността на клетките е 80%, хранителната среда се заменя с прясна среда без серум в продължение на 4–6 дни. За измерване на имунофлуоресценция, предметни стъкла с клетки се фиксират с 4% полиформалдехид за 30 минути, инкубират се с глицин (2 mg/ml) за 5 минути и след това се блокират с 5% BSA за 20 минути. След това се добавя заешко анти-ацетил-а-тубулиново (1: 500, Abcam) антитяло и се инкубира в продължение на една нощ при 4 ° С. След измиване с PBST три пъти, клетките след това се инкубират с овче анти-заешко антитяло (1: 200, Santa Cruz), белязани с IgG/TR за 1 h при 37 ° С и след това се измиват с PBST три пъти. Ядреното оцветяване се извършва с DAPI реагент в продължение на 7 минути и след това предметното стъкло се запечатва. Положителната флуоресцентна микроскопия (ECLIPSE NI, Nikon, Япония) е използвана за наблюдение и фотографиране на клетки.

Количествена PCR в реално време

cDNA беше синтезирана от обща РНК (1 μg), пречистена с помощта на TRIzol реагент, и след това беше извършена количествена PCR в обратна транскрипция в реално време (qRT-PCR) върху термоциклер Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Сидни, Австралия) с помощта на KAPA SYBR FAST Universal 2X qRT-PCR Master Mix (Kapa Biosystems, Woburn, MA, САЩ). Грундовете за FGFR1, IGF1R, ABI2 и NEDD9, Aurora A, HDAC6 са проектирани от Sangon Biotech (Шанхай, Китай). Параметрите на PCR реакцията са както следва: 1 цикъл от 95 ° С за 3 минути, последван от 40 цикъла, всеки от които включва три стъпки от 95 ° С за 3 s, 55 ° C за 15 s и 72 ° C за 30 s. Всички PCR проби се приготвят в три екземпляра и относителните нива на експресия на иРНК се нормализират до GAPDH и се определят по метода 2 ΔΔCt.

Експеримент за нашествие на Трансуел

Камерите за инвазия на Transwell (номер на артикул: 354480, Corning) бяха използвани за откриване на способността за клетъчна инвазия. Средата без серум се загрява предварително при 37 ° С, добавя се към горната камера и се инкубира в инкубатор при 37 ° С за 2 часа. След изхвърляне на средата, 500 μl прясна среда, съдържаща 10% FBS, се добавя към долната камера и 300 μl клетъчна суспензия (2 × 105 клетки/ml) се добавя към горната камера. След инкубация в продължение на 24 часа, камерата се отстранява, промива се два пъти с PBS и след това се фиксира с 5% глутаралдехид за 30 минути при 4 ° С. Клетките се оцветяват с 1% разтвор на кристално виолетово оцветяване в продължение на 20 минути и след това се промиват три пъти с PBS. Клетките на горната повърхност бяха почистени с памучни топки и ние снимахме клетките в долната повърхност на камерата с помощта на обърнат микроскоп (Nikon, Япония). Средната стойност се определя чрез осредняване на броя на клетките, преброени в девет зрителни полета.

Уестърн-блот експеримент

Уестърн-блотинг се използва за откриване и анализ на нивата на протеини в клетките и туморните тъкани. Общите протеини се екстрахират от клетки или тъкани, количествено се определят с метода на BCA реагент и след това се разделят с 8% или 10% (w/v) SDS-PAGE. Протеинът се прехвърля в PVDF мембрана (Bio-Rad, Hercules), блокира се за 1,5 h с 5% (w/v) обезмаслено мляко в TBST при стайна температура и се инкубира през нощта при 4 ° C с Prdx1 антитялото (1: 10000, Abcam), NEDD9 антитяло (1: 1000, клетъчна сигнална технология), p-Aurora A антитяло (1: 1000, Gentex), Aurora A антитяло (1: 10000, Abcam), HDAC6 антитяло (1: 10000, Abcam) или GAPDH антитяло (1: 10000, Abcam). Мембраните се промиват три пъти с TBST и след това се инкубират с конюгирано с пероксидаза от хрян (HRP) вторично антитяло за 1 h при стайна температура. Протеиновият сигнал е открит с помощта на система за образно изследване на протеинов гел (ChemiDocXRS + Imaging System; Bio-Rad).

Статистически анализ

Всички данни са изразени като средна стойност ± SEM. Бяха извършени еднопосочен дисперсионен анализ и t тест, за да се сравнят разликите между различните проби. Всички данни бяха анализирани с помощта на софтуера GraphPad Prism 5.0. Разликата беше статистически значима, ако P

Резултати

Инхибирането на prdx1 възстановява първичните реснички и потиска туморната инвазия

За да изследваме ефекта от инхибирането на Prdx1 върху ресничките и клетъчната функция, използвахме откриване на генни чипове, последвано от експерименти в клетки, за да проверим находките. Лентивирус (shPrdx1) беше трансфектиран в клетки EC9706, за да инхибира експресията на Prdx1. EC9706 клетки, трансфектирани с shPrdx1 лентивирус и shControl лентивирус (отрицателен контрол) бяха подложени на анализ на генни чипове, за да се изследват потенциалните промени в генната експресия и сигналните пътища на клетките след инхибиране на Prdx1 .

prdx1

Prdx1 регулира изразяването на оста на сигнала за разглобяване на реснички на NEDD9-Aurora A-HDAC6 в ESCC

Tripolin обърна ефектите на свръхекспресирания Prdx1 върху разглобяването на ресничките и туморната инвазия

Инхибирането на Prdx1 намалява туморогенезата, намалява обема и теглото на тумора и насърчава регенерацията на ресничките

Намалено Prdx1 регулира надолу сигналната ос за дезагрегация на реснички NEDD9-Aurora A-HDAC6 в туморната тъкан

Освен това анализирахме вътреклетъчните протеини на животински тумори при голи мишки. Експресията на Prdx1 е намалена в групата shPrdx1 в сравнение с нивото в отрицателната контролна група. Освен това нивата на експресия на вътреклетъчните NEDD9, p-Aurora A и HDAC6 също са значително намалени в групата shPrdx1 (Фиг. 7). Това е в съответствие с горните резултати от клетъчния анализ и допълнително показва, че действието на Prdx1 за насърчаване на дезагрегацията на карцинома реснички и туморната инвазия в сквамозните клетки на хранопровода е постигнато чрез модулация на сигналната ос NEDD9-Aurora A-HDAC6.

Дискусия

Prdx1 е член на семейството на пероксидно-окислително-редукционните ензими и неговата анормална експресия е тясно свързана с множество видове тумори [37,38,39]. Последните проучвания показват, че високата експресия на Prdx1 може да насърчи появата и прогресията на езофагеален карцином и че инхибирането на експресията на Prdx1 може да повиши чувствителността към лъчева и химиотерапия за лечение на карцином на хранопровода [40, 41]. По-рано установихме, че Prdx1 може да насърчи дезагрегацията на ресничките в ESCC и да укрепи способността за инвазия на туморните клетки. Освен това, инхибирането на експресията на Prdx1 може да насърчи регенерацията на ресничките и да регулира надолу активността на маркера за дезагрегация на ресничките Aurora A [3, 10]. Тук инхибирането на експресията на Prdx1 в ESCC клетки значително регулира нагоре гени, свързани с регенерацията на ресничките, и гени, регулирани надолу, свързани с дезагрегацията на ресничките. Експериментите с клетки и животни демонстрират, че Prdx1 играе роля в регулирането на критичната сигнална ос на NEDD9-Aurora A-HDAC6 за дезагрегация на реснички и влияе върху образуването на тумори и способността за инвазия на ESCC клетките. Тези резултати показаха, че Prdx1 е критичен регулатор на дезагрегацията на ресничките в ESCC, което го прави важна цел за лечение.

Инхибирането на експресията на Prdx1 с лентивирус shPrdx1 насърчава образуването на реснички в EC9706 клетки и инхибира капацитета за инвазия на туморните клетки. При голи мишки способността за образуване на тумор, обемът на тумора и теглото на тумора значително намаляват след инхибиране на Prdx1. По този начин Prdx1 може да насърчи появата и прогресирането на ESCC чрез индуциране на дезагрегация на ресничките. Нашите резултати са в съответствие с други открития, че инхибирането на Prdx1 може да инхибира появата, инвазията и метастазирането на тумори [42, 43]. Предложени са множество механизми за обяснение на ефектите на Prdx1 върху деполимеризацията на ресничките. Chae Soomin et al. [44] установи, че нокдаунът на Prdx1 значително инхибира образуването на проксимални тубули в пронефроса по време на ембриогенезата, значително увеличава клетъчните нива на реактивните кислородни видове (ROS) и нарушава образуването на първични реснички, констатации, които не са в съответствие с нашите наблюдения. Разликата в дейностите може да отразява различните роли на Prdx1 в образуването на реснички за различни клетъчни компоненти и различни болестни състояния. Необходими са допълнителни експерименти за разширяване на тези експерименти, за да се характеризира ефектът от Prdx1 върху ресничките.

Няколко проучвания показват, че Prdx1 насърчава появата на тумори главно чрез регулиране нивата на ROS, TGF-β1, mTOR/p70S6K и ROS/ERK/циклин D1 [47,48,49]. Въпреки това, ефектът и механизмът на Prdx1 върху плоскоклетъчния карцином на хранопровода все още трябва да бъдат изследвани допълнително. Тук демонстрирахме, че сигналната пътека NEDD9-Aurora A-HDAC6 играе важна роля в дезагрегацията на ресничките и туморната инвазия. Резултатите от експериментите с животни и клетъчни култури показаха, че сигналната ос медиира ролята на Prdx1 за насърчаване на появата и прогресирането на дезагрегацията на ресничките и ESCC. Може да има допълнителни молекулярни механизми, чрез които Prdx1 да повлияе на появата и прогресията на ESCC. Освен това приложимостта на наблюдаваните ефекти на Prdx1 върху сигналната ос на NEDD9-Aurora A-HDAC6 към други туморни аспекти изисква бъдещо проучване.

Заключение

Нашите резултати показват, че Prdx1 е нов регулатор на образуването на първични реснички в ESCC клетки.

Наличност на данни и материали

Всички данни, генерирани или анализирани по време на това проучване, са включени в тази публикувана статия [и нейните допълнителни информационни файлове].