p-нитрофенил фосфат (PNPP) е непротеинов, неспецифичен субстрат, използван за анализ на протеинови, алкални и киселинни фосфатази.

  • Може да се използва за бърз анализ на активността на протеин фосфатазата при всякакви условия
  • Изгодно за радиоактивен анализ, тъй като концентрацията на субстрата може да бъде много по-висока от Km
  • Активността се измерва с помощта на непрекъснат или едноточков спектрофотометричен анализ, базиран на способността на фосфатазите да катализират хидролизата на PNPP до р-нитрофенол, хромогенен продукт, който абсорбира максимално при 405 nm

фосфат

p-нитрофенил фосфат (PNPP) е непротеинов, неспецифичен субстрат, използван за анализ на протеинови, алкални и киселинни фосфатази. PNPP фосфатазната активност се измерва с помощта на непрекъснат или едноточков спектрофотометричен анализ, базиран на способността на фосфатазите да катализират хидролизата на PNPP до p-нитрофенол, хромогенен продукт с абсорбция при 405 nm (1). Анализът може да се използва за бърз анализ на активността на протеин фосфатазата при всякакви нестандартни условия.

Предимството на анализа на PNPP фосфатазната активност е, че за разлика от радиоактивните тестове концентрацията на субстрата може да бъде много по-висока от Km. Началната скорост може да бъде записана при непрекъснатия анализ, но обемът на анализа е по-голям, отколкото при радиоактивен анализ (около 1 ml за запълване на 1 ml кювета за спектрофотометър) (1,2). Реакционният обем в едноточков анализ може да бъде много малък, тъй като реакцията се спира с количеството NaOH, достатъчно за запълване на кюветата (1,3,4).

Доставени реактиви

Следните реактиви се доставят с този продукт:

NEB #Component NameComponent #Stored at (° C) AmountConcentration
    P0757S-20.
p-нитрофенил фосфат (PNPP) P0757SVIAL -20. 1 х 1 мл 500 mM
p-нитрофенил фосфат (PNPP) P0757SVIAL -20. 5 х 1 мл 500 mM

Молекулно тегло

  1. Да се ​​съхранява защитено от светлина.
  2. Анализ на протеин фосфатаза: Анализът на PNPP фосфатазната активност е много прост, не е скъп и рутинно се използва за единично определяне на всички NEB протеинови фосфатази. PNPP има очевидни Km стойности за протеинови фосфатази в диапазона от 0,5 -10 mM (2-5).

Активността на PNPP фосфатазата се изследва в реакционна смес (50 μl), съдържаща 50 mM PNPP и протеинов фосфатазен буфер, допълнен с допълнителни компоненти, когато е необходимо. Реакцията се инициира чрез добавяне на ензим и се гаси след 5-10 минути чрез добавяне на 1 ml 1 N NaOH (или 1 ml 0,5 M EDTA за Mn2 + -зависими протеинови фосфатази, Lambda PP и PP1). Количеството на продукта, р-нитрофенол, се определя чрез отчитане на абсорбцията при 405 nm и използване на моларен коефициент на екстинкция от 18 000 M-1 cm-1 (16 000 M-1 cm-1 за 0,5 M EDTA) (1, 3).

Една единица от активността на протеин фосфатазата се определя като количеството ензим, който хидролизира 1 наномол PNPP за една минута при 30 ° C в общ реакционен обем от 50 μl при стандартно реакционно състояние.

За да се оцени точно активността на протеин фосфатазата, от съществено значение е да се осигури линейна кинетика на дефосфорилиране.

Популярен
Те четат сега