ОРИГИНАЛНИ СТАТИИ

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Цитати
  • Метрика
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

Резюме

Въведение

През последните 15 години проучванията показват, че вроденият имунен отговор има основна роля, предоставяйки инструкции за последващия придобит отговор (Fearon & Locksley, 1996; Bendelac & Fearon, 1997; Medzhitov & Janeway, Jr, 1997a, 1997b; Parish & O ' Neill, 1997), която започва с разпознаване на себе си от не-себе си чрез откриване на патоген-асоциирани молекулни модели (PAMPs), разпознати от рецепторите за разпознаване на модели (PRR) върху клетките гостоприемници (Romagnani, 1992; Fearon & Locksley, 1996; Anderson, 2000; Музио и др., 2000; Акира, 2001; Акира и др., 2001; Janeway, Jr & Medzhitov, 2002).

пълна

Като първите клетки, които мигрират към мястото на инфекцията, полиморфонуклеарните левкоцити (PMN) са критични компоненти на вродения имунен отговор и последващия възпалителен отговор (Hachicha и др., 1998; Ямаширо и др., 2001; Кобаяши и др., 2002). Хетерофилите са основният PMN при пилетата и са птичи аналог на неутрофилите на бозайниците и функционират за модулиране на острата вродена реакция на гостоприемника чрез бърза фагоцитоза на нахлуващи микроби и чужди частици, която активира сигналните механизми, производството на междинни кислородни продукти, освобождавайки протеолитични ензими и цитокини/хемокини (Kaiser и др., 2000; Когут и др., 2001, 2003, 2007; Mannering & Cheers, 2002; Той и др., 2003). Колективно тези проучвания ясно показват значителната роля на хетерофилите в вродения имунен отговор и последващата защита при младите птици (Kogut и др., 1994).

Материали и методи

Експериментални пилета

Родителските пилета-бройлери, използвани в това проучване, са получени от търговски животновъд. За да се запази поверителността, линиите бяха обозначени A и B. Оплодените яйца бяха инкубирани и излюпени при стандартни условия (влажни и сухи температури на крушките съответно 32 ° C и 37,5 ° C) (Austic & Nesheim, 1990). В люка пилетата бяха поставени в подови кошари (8 фута × 8 фута), съдържащи дървени стърготини и снабдени с допълнителна топлина. Те получиха вода и балансирана диета, базирана на царевица и соево брашно, без лекарство ad libitum. Фуражът е изчислен, че съдържа 23% протеин и 3200 kcal метаболизираща енергия/kg диета, а всички други хранителни дажби отговарят или надвишават стандартите, установени от Националния съвет за изследвания (1994).

Бактерии

Изолат от домашни птици от Salmonella enterica подвид ентерика serovar Enteritidis (SE, # 97-11771) е получен от Националната лаборатория за ветеринарни услуги (Ames, Айова, САЩ) и е култивиран в триптичен соев бульон (Difco Laboratories, Becton Dickinson Co., Sparks, Maryland, USA) за една нощ в 41 ° С. Запас SE (1 × 10 9 образуващи колонии единици/ml) се приготвя прясно за всеки експеримент, както е описано по-рано, и се държи на лед, докато се използва (Swaggerty и др., 2003б).

Изолация на хетерофили

Хетерофили са изолирани от периферна кръв от 150 пилета на линия 1 ден след излюпването. След вземането на кръв бяха изолирани хетерофили, както е описано по-рано (Swaggerty и др., 2003b). Накратко, кръв от пилета се събира в епруветки Vacutainer®, съдържащи динатриев етилендиамин тетраоцетна киселина (EDTA) (BD Vacutainer, Franklin Lakes, Ню Джърси, САЩ) и се разбърква старателно. Кръвта и EDTA за всяка линия се събират и разреждат 1: 1 с RPMI 1640 среда, съдържаща 1% метилцелулоза и се центрофугират при 40 ×ж за 15 минути при 4 ° С. Супернатантата се прехвърля в нова конична епруветка и се разрежда с балансиран солев разтвор на Hank без магнезий и без Mg 2 + (1: 1), наслоява се върху непрекъснати градиенти на Histopaque® (специфично тегло 1,077 над 1,119) и се центрофугира при 190 ×ж за 1 h при 4 ° C. Слоевете Histopaque® бяха събрани, измити с RPMI 1640 (1: 1) и гранулирани при 485 ×ж за 15 минути при 4 ° С. След това клетките бяха суспендирани отново в прясна RPMI 1640, преброени на хемоцитометър и разредени до 1 × 10 7/ml в RPMI. Хетерофилните препарати са постоянно 95% чисти и> 95% жизнеспособни. Всички реактиви и химикали за тъканни култури са получени от Sigma Chemical Company (Сейнт Луис, Мисури, САЩ), освен ако не е посочено друго.

Анализ на протеин тирозин киназа

Общият фосфорилиран PTK се определя количествено, като се използва наличен в търговската мрежа комплект (каталожен номер PTK101; Sigma). Хетерофилите (4 х 106/ml) се третират с RPMI (контрол) или SE в продължение на 1 h при 39 ° С върху рокер и реакцията спира чрез добавяне на 100 ul 20% хлорна киселина. Допълнителни проби, третирани с инхибитор генистеин, широкоспектърен PTK инхибитор, също бяха включени (200 цМ), за да покажат специфичност (Sigma Chemical Co.). Хетерофилите са гранулирани (485 ×ж в продължение на 15 минути), супернатантата се изхвърля и клетките се промиват с фосфатно буфериран физиологичен разтвор. След измиването супернатантата се декантира и се добавя ледено буфер за лизис (2 ml); клетките бяха суспендирани отново и държани на лед в продължение на 30 минути. Лизираните клетки се отстраняват чрез центрофугиране (10 000 хж за 15 минути при 4 ° С) и супернатантата се събира и разрежда 1: 1 в тирозин киназен буфер и се следват инструкциите на производителя. След добавяне на стоп разтвор, плочата се отчита при 492 nm в рамките на 5 минути (GENios Plus Fluorescence Microplate Reader; TECAN US Inc, Research Triangle Park, Северна Каролина, САЩ).

MAPK семейство (p38, ERK и JNK) имуноанализи

ELISA за измерване на активиране на AP-1 и NF-κB транскрипционни фактори

Бяха оценени и транскрипционните фактори от семействата AP-1 и NF-κB. Членовете на семейството AP-1, включително c-Jun, c-Fos, FosB, Fra-1, JunD и JunB, бяха измерени с помощта на търговски наличен ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) (TransAM AP-1 семеен транскрипционен фактор комплект за анализ; Активен мотив, Карлсбад, Калифорния, САЩ); Членовете на семейството на NF-κB, включително p65, p50, p52, c-Rel и RelB, бяха измерени с помощта на набора за анализ на транскрипционния фактор на TransAM NF-κB (Active Motif). Подготовката на пробите е еднаква и за двата анализа. Накратко, хетерофилите (1 × 10 7) бяха третирани с RPMI (контрола) или SE в продължение на 1 h при 39 ° C върху рокер и клетките бяха събрани чрез центрофугиране (2430 ×ж в продължение на 5 минути при 4 ° С) и се лизира със съответния прясно приготвен лизисен буфер. Лизисът се провежда върху лед в продължение на 30 минути и пробите се завихрят на всеки 10 минути. Лизатите се центрофугират при 9720 хж за 5 минути при 4 ° С и супернатантите се събират и съхраняват при -70 ° С, докато се извърши анализът. ELISA се провеждат съгласно протокола на производителя. След добавяне на стоп разтвора се отчитат стойностите на абсорбцията при 450 nm в рамките на 5 минути (GENios Plus Fluorescence Microplate Reader).

статистически анализи

Събира се антикоагулирана кръв от 150 пилета на група и се изолират хетерофили. Всяко събиране на кръв и изолиране на хетерофили се провежда в четири отделни дни (хетерофили, събрани от общо 600 пилета на линия). Всички сравнения и статистически анализи бяха извършени върху контролите спрямо третираните стойности за всеки ред; не бяха направени сравнения между редовете. Средната и стандартната грешка на средната стойност са изчислени от обединени данни. Статистически анализи (Student's т тест) са извършени с помощта на Microsoft® Excel 2007 (P Сигналните пътища на протеин тирозин киназа и митоген активирана протеин киназа допринасят за разликите в медиираната от хетерофили вродена имунна реакция между две линии бройлери

Публикувано онлайн:

Фигура 1. Обща фосфорилирана активност на PTK. Хетерофили бяха изолирани от 1-дневни пилета, стимулирани с RPMI (контроли) или SE за 1 h при 39 ° C и общите международни единици фосфорилиран PTK, количествено определени с помощта на наличен в търговската мрежа ELISA. Контролните стойности на линия А и стимулираните от SE стойности са значително (P≤ 0,05) по-високи от тези, наблюдавани за линия В (посочени със *). Лечението на хетерофили с генистеин, широкоспектърен PTK инхибитор, преди излагане на SE поддържа нивата на PTK сравними с контролите. Значителни разлики между леченията, посочени с # (P≤ 0,05). Показаните резултати представляват средната стойност на четири отделни експеримента, а лентите за грешки са средната стойност ± стандартна грешка.

Фигура 1. Обща фосфорилирана активност на PTK. Хетерофилите бяха изолирани от еднодневни пилета, стимулирани с RPMI (контроли) или SE за 1 h при 39 ° C и общите международни единици фосфорилиран PTK, количествено определени с помощта на наличен в търговската мрежа ELISA. Контролните стойности на линия А и стимулираните от SE стойности са значително (P≤ 0,05) по-високи от тези, наблюдавани за линия В (обозначени със *). Лечението на хетерофили с генистеин, широкоспектърен PTK инхибитор, преди излагане на SE поддържа нивата на PTK сравними с контролите. Значителни разлики между леченията, посочени с # (P≤ 0,05). Показаните резултати представляват средната стойност на четири отделни експеримента, а лентите за грешки са средната стойност ± стандартна грешка.

Семейство MAPK

Също така искахме да определим дали има измерими разлики между компонентите на сигналните пътища на супер-семейството MAPK. Общо p38, ERK и JNK протеини (pg/ml) бяха количествено определени в контролни и SE-стимулирани хетерофили от пилета от линия А и В. Базалните нива на p38 са по-високи (P Сигналните пътища на протеин тирозин киназа и митоген активирана протеин киназа допринасят за разликите в медиираната от хетерофили вродена имунна реакция между две линии бройлери

Публикувано онлайн:

Фигура 2. Общо нива на p38 протеин. Хетерофили бяха изолирани от 1-дневни пилета, стимулирани с RPMI (контроли) или SE за 1 h при 39 ° C и нива на p38 протеин (pg/ml), количествено определени с помощта на наличен в търговската мрежа ELISA. Контролните стойности на линия А и стимулираните от SE стойности са значително (P ≤ 0,05) по-високи от тези, наблюдавани за линия В (посочени със *). Лечението на хетерофили със SB203580, специфичен p38 инхибитор, преди излагане на SE запазва нивата, подобни на контролите. Значителни разлики между леченията, посочени с # (P ≤ 0,05). Показаните резултати представляват средната стойност на четири отделни експеримента, а лентите за грешки са средната стойност ± стандартна грешка.

Фигура 2. Общо нива на p38 протеин. Хетерофили бяха изолирани от 1-дневни пилета, стимулирани с RPMI (контроли) или SE за 1 h при 39 ° C и нива на p38 протеин (pg/ml), количествено определени с помощта на наличен в търговската мрежа ELISA. Контролните стойности на линия А и стимулираните от SE стойности са значително (P ≤ 0,05) по-високи от тези, наблюдавани за линия В (посочени със *). Лечението на хетерофили със SB203580, специфичен p38 инхибитор, преди излагане на SE запазва нивата, подобни на контролите. Значителни разлики между леченията, посочени с # (P ≤ 0,05). Показаните резултати представляват средната стойност на четири отделни експеримента, а лентите за грешки са средната стойност ± стандартна грешка.

В сравнение с активността на PTK и p38, се наблюдава различен модел за JNK. Базалните нива на JNK (pg/ml) са по-високи (P Сигналните пътища на протеин тирозин киназа и митоген активирана протеин киназа допринасят за разликите в медиираната от хетерофили вродена имунна реакция между две линии бройлери

Публикувано онлайн:

Фигура 3. Общи нива на протеин JNK. Хетерофили бяха изолирани от 1-дневни пилета, стимулирани с RPMI (контроли) или SE за 1 h при 39 ° C и нива на JNK протеин (pg/ml), количествено определени с помощта на наличен в търговската мрежа ELISA. Контрол на линия В и стимулирани от SE стойности са значително (P ≤ 0,05) по-високи от тези, наблюдавани за линия A (посочени със *). Лечението на хетерофили със SP600125, специфичен инхибитор на JNK, преди излагане на SE запазва нивата, подобни на контролите. Значителни разлики между леченията, посочени с # (P ≤ 0,05). Показаните резултати представляват средната стойност на четири отделни експеримента, а лентите за грешки са средната стойност ± стандартна грешка.

Фигура 3. Общи нива на протеин JNK. Хетерофили бяха изолирани от 1-дневни пилета, стимулирани с RPMI (контроли) или SE за 1 h при 39 ° C и нива на JNK протеин (pg/ml), количествено определени с помощта на наличен в търговската мрежа ELISA. Контрол на линия В и стимулирани от SE стойности са значително (P ≤ 0,05) по-високи от тези, наблюдавани за линия A (посочени със *). Лечението на хетерофили със SP600125, специфичен инхибитор на JNK, преди излагане на SE запазва нивата, подобни на контролите. Значителни разлики между леченията, посочени с # (P ≤ 0,05). Показаните резултати представляват средната стойност на четири отделни експеримента, а лентите за грешки са средната стойност ± стандартна грешка.

Нивата на ERK са измерени в контролни и SE-стимулирани хетерофилни препарати от линии А и В (Фигура 4). Не са наблюдавани разлики между линиите или между контролни и стимулирани проби и лечението на хетерофили с PD98059, инхибитор на ERK, преди стимулацията също няма ефект.

Публикувано онлайн:

Фигура 4. Общи нива на ERK протеин. Хетерофилите бяха изолирани от 1-дневни пилета, стимулирани с RPMI (контроли) или SE в продължение на 1 h при 39 ° C и ERK нива на протеин (pg/ml), количествено използвани с наличен в търговската мрежа ELISA. Няма разлика между контролните нива и нивата, стимулирани от SE, за нито една линия. Лечението на хетерофили с PD98059, специфичен инхибитор на ERK, преди излагане на SE не е имало ефект. Показаните резултати представляват средната стойност на четири отделни експеримента, а лентите за грешки са средната стойност ± стандартна грешка.

Фигура 4. Общи нива на ERK протеин. Хетерофилите бяха изолирани от 1-дневни пилета, стимулирани с RPMI (контроли) или SE в продължение на 1 h при 39 ° C и ERK нива на протеин (pg/ml), количествено използвани с наличен в търговската мрежа ELISA. Няма разлика между контролните нива и нивата, стимулирани от SE, за нито една линия. Лечението на хетерофили с PD98059, специфичен инхибитор на ERK, преди излагане на SE не е имало ефект. Показаните резултати представляват средната стойност на четири отделни експеримента, а лентите за грешки са средната стойност ± стандартна грешка.

Транскрипционни фактори

Измерват се активиращи транскрипционни фактори от семейство AP-1, включително c-Jun, c-Fos, FosB, Fra-1, JunD и JunB. Всеки протеин беше измерен в контролни и SE-стимулирани хетерофили, изолирани от пилета от линия А и линия В. Единствената разлика между линии A и B се наблюдава при c-Jun (Фигура 5). Контролните нива са сравними между двете линии, докато нивата са значително (P Сигналните пътища на протеин тирозин киназа и митоген активирана протеин киназа допринасят за разликите в медиираната от хетерофили вродена имунна реакция между две линии бройлери

Публикувано онлайн:

Фигура 5. Активиране на семейството на AP-1 транскрипционен фактор. Хетерофилите бяха изолирани от еднодневни пилета, стимулирани с RPMI (контроли) или SE за 1 h при 39 ° C и активиране на c-Jun, c-Fos, FosB, Fra-1, JunD и JunB, определени с търговска употреба -достъпен ELISA. Активирането на c-Jun е значително (* P ≤ 0,05) по-високо в третирани с SE SE лекувани хетерофили, докато линия В е непроменена от контролните нива. Всички останали имат подобни модели на активиране. Абсорбцията се отчита при 450 nm. Показаните резултати представляват средната стойност на четири отделни експеримента, а лентите за грешки са средната стойност ± стандартна грешка.

Фигура 5. Активиране на семейството на AP-1 транскрипционен фактор. Хетерофилите бяха изолирани от еднодневни пилета, стимулирани с RPMI (контроли) или SE за 1 h при 39 ° C и активиране на c-Jun, c-Fos, FosB, Fra-1, JunD и JunB, определени с търговска употреба -достъпен ELISA. Активирането на c-Jun е значително (* P ≤ 0,05) по-високо в третирани с SE SE лекувани хетерофили, докато линия В е непроменена от контролните нива. Всички останали имат подобни модели на активиране. Абсорбцията се отчита при 450 nm. Показаните резултати представляват средната стойност на четири отделни експеримента, а лентите за грешки са средната стойност ± стандартна грешка.

Активирането на транскрипционни фактори от семейството NF-κB, включително p50, p52, p65 (RelA), c-Rel и RelB, също бяха измерени в контролни и SE-стимулирани хетерофили, изолирани от линии A и B (Фигура 6). Активирането на p50 беше по-високо (P Сигналните пътища на протеин тирозин киназа и митоген активирана протеин киназа допринасят за разликите в медиираната от хетерофили вродена имунна реакция между две линии бройлери

Публикувано онлайн:

Фигура 6. Активиране на семейството на NF-κB транскрипционен фактор. Хетерофилите бяха изолирани от 1-дневни пилета, стимулирани с RPMI (контроли) или SE за 1 h при 39 ° C и активиране на p50, p52, p65, c-Rel и RelB, количествено използвани с наличен в търговската мрежа ELISA. Активирането на p50 е значително (* P ≤ 0,05) по-високо при третирани с SE SE хетерофили, докато линия B е непроменена от контролните нива. Всички останали имат подобни модели на активиране. Абсорбцията се отчита при 450 nm. Показаните резултати представляват средната стойност на четири отделни експеримента, а лентите за грешки са средната стойност ± стандартна грешка.

Фигура 6. Активиране на семейството на NF-κB транскрипционен фактор. Хетерофилите бяха изолирани от 1-дневни пилета, стимулирани с RPMI (контроли) или SE в продължение на 1 h при 39 ° C и активиране на p50, p52, p65, c-Rel и RelB, количествено използвани с наличен в търговската мрежа ELISA. Активирането на p50 е значително (* P ≤ 0,05) по-високо при третирани с SE SE лекувани хетерофили, докато линия В е непроменена от контролните нива. Всички останали имат подобни модели на активиране. Абсорбцията се отчита при 450 nm. Показаните резултати представляват средната стойност на четири отделни експеримента, а лентите за грешки са средната стойност ± стандартна грешка.

Дискусия

Колективно тези данни показват, че повишената отзивчивост на пилета от линия А и/или техните хетерофили се влияе отчасти от повишената способност да инициират пътища за предаване на критичен сигнал, медиирани като цяло от PTK, както и от специфични членове на супер семейството MAPK, което следователно пряко влияе върху инициирането и последващото производство на ефективен вроден имунен отговор. В резултат на тези констатации, подборът на пилета за повишено активиране на специфични сигнални пътища може да създаде поредица от птици, която е по-устойчива и по-отзивчива срещу широк спектър от патогени въз основа на по-ефективен вроден имунен отговор. Пилетата, които по своята същност са по-устойчиви на домашни птици и хранителни патогени, вероятно ще имат повишена пригодност за живот в полето и може да имат намалени нива на хранителни патогени, като по този начин намаляват възможността за предаване от птичия гостоприемник в хранителните доставки.

Благодарности

Авторите благодарят на Laura Ripley и M. Reiley Street, Jr, за техническа помощ и/или помощ в грижите за животните. Експериментите бяха проведени в съответствие с насоките, установени от Комитета за грижа за животните на USDA. Споменаването на търговски продукти е единствената цел да се предостави конкретна информация; не за препоръка или одобрение от USDA.