Оригинална статия

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Цитати
  • Метрика
  • Лицензиране
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

РЕЗЮМЕ

Въведение

Морската краставица е бодлокожи и един от важните култивирани водни видове в Китай и други азиатски страни поради високата си търговска стойност. [1] Общото световно производство на морска краставица през 2013 г. е около 232 000 тона (FAO). Stichopus japonicus (S. japonicus) е икономически най-важният вид от повече от 20 ядливи морски краставици в Китай. [2] Трудно е да се поддържа високото качество на S. japonicus по време на редовна термична обработка поради специалния физиохимичен състав на S. japonicus телесна стена (SJBW), която влияе върху нейните текстурни свойства, което причинява големи икономически загуби в индустрията за морски дарове. [3, 4] Следователно е много важно да се разберат параметрите, които контролират текстурната промяна на SJBW по време на термична обработка и как да се подобри качеството му по време на обработката.

статия

Доколкото ни е известно, за процеса на нагряване в SJBW повечето изследвания налагат оценката на качеството чрез различни техники, [2, 14], но малко се знае защо структурата се е променила и дали оксидативният стрес е предизвикал явлението. Следователно целта на това проучване е да проучи допълнително потенциалните ефекти на ROS и техните сигнализиращи протеини и ензими надолу по веригата върху структурата на SJBW и да разкрие механизма на текстурните промени в SJBW по време на нискотемпературно третиране, което ще осветява как да подобрим допълнително термичните процеси, необходими за поддържане на високото качество на SJBW.

Материали и методи

Материали и химикали

Жив S. japonicus (150 ± 20 g) е закупен от местен воден пазар в Далиан (Китай). Говежди серумен албумин (BSA), N, N, N, N-тетраметилетилендиамин (TEMED), натриев додецил сулфат (SDS), дитиотреитол (DTT) и Coomassie брилянтен син R-250 са получени от Sangon Biotech Co., Ltd (Шанхай, Китай). Фенилметансулфонил флуорид (PMSF) и етилендиаминтетраацетат (EDTA) са получени от Sigma Chemical (St. Louis, MO). Комплектът за активност Caspase-3 е получен от Института по биотехнологии Beyotime (Хаймен, Китай). Субстратът от катепсин L е закупен от биотехнологията Santa Cruz (Шанхай, Китай). Всички други химикали, използвани в това проучване, са с аналитичен клас.

Нискотемпературно лечение

Вътрешните органи и главите бяха отстранени от пресни морски краставици. Стените на тялото бяха пренесени в чаши на Петри с по 3-5 индивида във всяка и бяха държани в HH3 Електротермостатична водна баня (Changzhou Zhongbei Instrument co. LTD, Jiangsu, China) при 37 ° C за 1/6, 1/2, 1, 3, 6, 12, 24 и 36 часа, съответно. Пробите се анализират периодично, за да се регистрират техните морфологични промени. Морските краставици бяха замразени в течен азот като контролни проби, а телесните стени без нагряване бяха като пробите от 0 часа. След това всички телесни стени и контролни проби се съхраняват при -80 ° C за по-нататъшни експерименти.

Определяне на съдържанието на разтворим колаген

Десет грама SJBW се суспендират в 10 ml свръхчиста вода и след това се поставят във водна баня при 80 ° C в продължение на 2 часа, като се разклащат на всеки 30 минути. След 2 часа пробите се центрофугират при 1500 х g за 30 минути. Определянето на съдържанието на разтворим колаген се провежда по метода AOAC 990.26, описан от Starkey et al. [15] Резултатите са изразени като mg/g SJBW.

Инструментален анализ на текстурата

Стойностите на твърдост и дъвчене бяха определени с помощта на анализатор на текстурата TA-XT2i (Stable Micro Systems, Surrey, UK), снабден с P/0.5 сонда. Пробите се нарязват на кубчета 1,5 × 1,5 × 1,5 cm за анализ. Всяка проба премина два цикъла на компресионен анализ с ниво на компресия 70% (спрямо ширината на пробата, 1 mm/s скорост на кръстосана глава), с 5 s време за релаксация между двата цикъла според Bourne и ръководството за SMS (Stable Micro Systems, Съри, Великобритания). [16]

Оценка на разграждането на протеини

Разграждането на протеина се анализира, като се използва електрофореза на натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел (SDS-PAGE) с 5% гел за подреждане и 10% течащ гел. Пробите се смилат с разтвор за екстракция на протеин (20 mM Tris-HCl (рН 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10 mM DTT, 1% Trition X-100, 0,1% SDS) с 1: 3 (w/v ) на лед. След това екстрактите се центрофугират при 12 000 × g в продължение на 15 минути, при 4 ° С и супернатантите се смесват с SDS-PAGE пробен буфер (0,25 М Tris-HCl (рН 7,5), 8 М урея, 5% SDS, 5% меркаптоетанол) в съотношение 4: 1 и се вари 5 минути. Сварените проби (10 μg) и маркерите се зареждат в кладенци за проби в гела за подреждане и се анализират с помощта на система Mini Protein (Bio-Rad Laboratories, Berkeley, California, USA). След отделяне и оцветяване с 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250, последвано от оцветяване с 30% метанол и 10% оцетна киселина.

Измерване на активността на CL

Пробите се хомогенизират с разтвор за екстракция на протеин (50 mM фосфатен буфер (рН 7,0), 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA) при 4 ° C чрез 1: 3 (w/v) използвани стъклени мелнички. След това хомогенатите се центрофугират при 9600 × g в продължение на 10 минути при 4 ° С чрез Legend Micro 17R центрофуга (Thermo Fisher Scientific, Ню Йорк, САЩ), супернатантите се събират за анализ на CL активността. Активността на CL се измерва съгласно Qi et al. [4] Z-Phe-Arg-Mec се използва като субстрат за определяне на CL активността. Активността на CL се изразява като U/mg протеин.

Оценка на фрагментацията на ДНК

Обработени проби от SJBW за различно време бяха събрани и ДНК беше получена по метода, описан от Miyoshi et al. [17] Извлечените проби от ДНК се изследват чрез електрофореза в 2,0% агарозни гелове; след това геловете се оцветяват с гел червено и се изобразяват с помощта на UV система (Bio-Rad Laboratories, Бъркли, Калифорния, САЩ).

Измерване на активността на каспаза-3

Пробите от SJBW се хомогенизират с лизисен буфер (25 mM HEPES (рН 7,4), 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 μM пепстатин, 1 mM PMSF) и лизатите се центрофугират при 9 600 × g за 10 минути при 4 ° С. След това супернатантите се инкубират със субстрат от каспаза-3 ацетил-Asp-Glu-Val-Asp стр-нитроанилид (Ac-DEVD-стрNA) за 30 минути при 37 ° С и абсорбцията се отчита при 405 nm. Концентрацията на протеин в супернатантите, използвани в тестовете за активност, се определя с помощта на Брадфорд. [18] Активността на каспаза-3, определена в третираните проби, се изразява чрез относително увеличение спрямо контролната група.

Уестърн блотинг

Пробите от SJBW се лизират в лизисен буфер (20 mM Tris-HCl (рН 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EGTA, 2 mM EDTA, 10 mM DTT, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 0,1% SDS, 1 % Trion X-100, 10 μg/ml леупептин, 10 μg/ml апротинин, 1 mM PMSF) върху лед. Лизатите се центрофугират при 10 000 х g в продължение на 15 минути, при 4 ° С и се събират супернатанти. Количествените протеини се определят количествено по метода на Брадфорд. Супернатантите се смесват с SDS-PAGE пробен буфер в съотношение 4: 1 и се варят 5 минути. След това 20 μg протеин се подлагат на 10% SDS-PAGE и общите протеини се прехвърлят в мембрани от поливинилиден дифлуорид (PVDF) (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA). Мембраните бяха блокирани и след това инкубирани с анти-р-р38 (разреждане 1: 1000), анти-р-ERK1/2 (разреждане 1: 2000), анти-р-JNK (разреждане 1: 1000) и анти-β- актиново антитяло (разреждане 1: 1000) за една нощ при 4 ° C, последвано от вторичното антитяло. Протеините бяха открити чрез реактив с повишена хемилуминесценция (ECL). Филмите бяха сканирани и анализирани от системата Chemi Doc (Bio-Rad Laboratories, Бъркли, Калифорния, САЩ).

ROS измерване

Пробите на SJBW бяха директно лиофилизирани, подложени на измерване на спин-улавянето на електронен спинов резонанс (ESR). Накратко, 20 mg лиофилизирани прахове се поставят в стъклена капилярна тръба и се поставят в ESR кухината. ESR спектрите са записани с помощта на ESR спектрометър (Bruker A200, Karisruhe, Германия) при стайна температура със следните настройки: микровълнова мощност 6,10 mw, широчина на излъчване 200,00 Gauss, централно поле 3460,00 Gauss, модулационна честота 100,00 kHz, амплитуда на модулация 1,00 gauss, времева константа 5242,88 ms и време за преобразуване 480,00 ms.

Статистически анализ

Всички данни бяха анализирани от SPSS 16.0 (SPSS Inc., 2001, Чикаго, IL, САЩ) и еднофакторен дисперсионен анализ (ANOVA). За всички анализи бяха проведени три отделни експеримента. Средствата ± SE бяха изчислени. Разликите между средствата се считат за значителни при р Оксидативен стрес, свързан с текстурни промени на морската краставица Stichopus japonicus телесна стена по време на лечение с ниска температура

Публикувано онлайн:

Фигура 1. Промени в морфологията и структурата на SJBW по време на нискотемпературна обработка при 37 ° C. а) морфологичното наблюдение; (б) разтворим колаген на SJBW при 37 ° C за различно анализирано време. Контролът беше прясната проба. Резултатът е представителен за три независими експеримента; в) промени в твърдостта на SJBW при 37 ° C за различно време; г) промени в дъвченето на SJBW при 37 ° C за различни периоди от време. Различните букви показват значителни разлики (p Фигура 1. Промени в морфологията и структурата на SJBW по време на нискотемпературна обработка при 37 ° C. (A) Морфологичното наблюдение; (b) разтворим колаген на SJBW при 37 ° C за различно анализирано време. Контролът беше прясната проба. Резултатът е представителен за три независими експеримента; (c) промени в твърдостта на SJBW при 37 ° C за различно време; (d) промени в дъвченето на SJBW при 37 ° C за различни периоди от време. Различните букви показват значителни разлики (p Оксидативен стрес, свързан с текстурните промени на морската краставица Stichopus japonicus телесна стена по време на лечение с ниска температура

Публикувано онлайн:

Фигура 2. Разграждане на протеини и промяна в активността на CL в SJBW по време на обработка при ниска температура при 37 ° C. (а) SDS-PAGE снимки на разграждане на протеини. Десет микрограма от всяка проба се зареждат в 10% (w/v) SDS-PAGE гел. HM, висока МАРКА; LM, ниска МАРКА; (b) CL активност, измерена с флуороспектрофотометър. Данните се отчитат като средна стойност ± SD въз основа на три повторения. Различните букви показват значителни разлики (p Фигура 2. Разграждане на протеини и промяна в активността на CL в SJBW по време на нискотемпературна обработка при 37 ° C. (A) SDS-PAGE снимки на разграждане на протеина. Десет микрограма от всяка проба са натоварени в 10% (w/v) SDS – PAGE гел. HM, висока MARK; LM, ниска MARK; (b) CL активност, измерена с флуороспектрофотометър. Данните се отчитат като средна стойност ± SD въз основа на три повторения. Различните букви показват значителни разлики (p [ 19] Фигура 2 (b) показва активността на CL, която се увеличава постепенно и достига максимална стойност от 156,1 ± 15,0 U/mg протеин (p Оксидативен стрес, участващ в структурни промени на морската краставица Stichopus japonicus телесна стена по време на лечение с ниска температура

Публикувано онлайн:
Публикувано онлайн:

Фигура 4. MAPK фосфорилиране в SJBW по време на нискотемпературна обработка при 37 ° C. Двадесет микрограма протеин бяха заредени на лента. Контролът беше прясната проба. Пробите бяха анализирани с Western blot за определяне на фосфорилирането на p38, JNK и ERK. като контрол на натоварването се използва β-актин. Резултатите са представителни за три независими експеримента.

Фигура 4. MAPK фосфорилиране в SJBW по време на нискотемпературна обработка при 37 ° C. Двадесет микрограма протеин бяха заредени на лента. Контролът беше прясната проба. Пробите бяха анализирани с Western blot за определяне на фосфорилирането на p38, JNK и ERK. като контрол на натоварването се използва β-актин. Резултатите са представителни за три независими експеримента.

Образуване на свободни радикали в SJBW по време на третиране при ниска температура

Образуването на свободни радикали се оценява чрез подлагане на лиофилизиран прах от SJBW на нискотемпературна обработка с използване на ESR спектроскопия. Фигура 5 (а) показва типични ESR спектри на пробите. Наблюдаваният ESR сигнал наподобява свободния радикал, произведен в повечето биологични системи с g = 2.03, който е идентичен с радикала, получен от ROS. Относителната интензивност на радикалния сигнал е показана на фигура 5 (b). Що се отнася до пробите, инкубирани при 37 ° C, относителната интензивност на радикалите се е увеличила значително (p 5) (p Оксидативен стрес, участващ в структурни промени на морската краставица Stichopus japonicus телесна стена по време на лечение с ниска температура

Публикувано онлайн:

Фигура 5. Производство на ROS в SJBW по време на нискотемпературна обработка при 37 ° C. (а) ESR спектри на лиофилизиран SJBW при 37 ° C за различно време, индуцирано производство на свободни радикали; (b) ниво на свободни радикали на лиофилизиран SJBW при 37 ° C. Различните букви показват значителни разлики (p Фигура 5. Производство на ROS в SJBW по време на нискотемпературна обработка при 37 ° C. (A) ESR спектри на лиофилизиран SJBW при 37 ° C за различно време, индуцирано производство на свободни радикали; (b) ниво на свободни радикали на лиофилизиран SJBW при 37 ° C. Различните букви показват значителни разлики (p Оксидативен стрес, свързан с текстурни промени на морската краставица Stichopus japonicus телесна стена по време на лечение с ниска температура

Публикувано онлайн:

Фигура 6. Схематична диаграма за предложени сигнални каскади в SJBW по време на нискотемпературна обработка при 37 ° C.

Фигура 6. Схематична диаграма за предложени сигнални каскади в SJBW по време на нискотемпературна обработка при 37 ° C.

Дискусия

SJBW се състои от епидермис, дерма и вътрешен кръгов мускулен слой. [21] Намаляването на качеството на SJBW е по-видимо в епидермиса, отколкото в дермата по време на нискотемпературна обработка при 37 ° C. Значителното увеличение на съдържанието на разтворим колаген с течение на времето се наблюдава в процеса на нискотемпературна обработка при 37 ° C в SJBW (Фигура 1 (b)). По подобен начин резултатите от повишеното съдържание на разтворим колаген са открити при термично обработени мускули на миди и агнешко лонгисимус през периодите на стареене. [12, 15] Тези проучвания показват, че колагенът е бил денатуриран и разграден по време на обработка с различна температура. В настоящото изследване резултатите от текстурния анализ могат да бъдат обяснени с разтварянето на колагена, тъй като промяната в съдържанието на разтворим колаген съвпада с спада на твърдостта и дъвченето. По същия начин, Lu et al. [22] съобщава, че твърдостта и еластичността на филетата от шаран при 4 ° C нараства до 8 часа, последвано от бавно намаляване до края на съхранението.

HMW и актинът са основните протеинови компоненти в SJBW и тяхното разграждане би имало значително влияние върху мускулната структура. [23] Разграждане на актин и HMW се наблюдава при нискотемпературна обработка при 37 ° C в SJBW (Фигура 2 (а)), подобно на това, наблюдавано при херинга, сом и тилапия. [23, 24] Отрицателна корелация съществува между разграждането на протеина и активността на CL след 3 часа при SJBW; разграждането на протеина може да се отдаде на натрупването на CL от 10 минути до 3 часа (Фигура 2 (b)). Ladratet et al. [25] също съобщава, че разграждането на протеини по време на съхранение на лаврак може да се отдаде на действието на CL.

Наблюдавано е увреждане на ДНК в SJBW по време на третиране при ниска температура (Фигура 3 (а)). Топлинният стрес може да предизвика разкъсване на ДНК и да инхибира репликацията на ДНК. [26] Каспаза-3 може да участва в увеличеното увреждане на ДНК, наблюдавано в скелетните мускули на животните. [27] Активността на каспаза-3 в SJBW първо се увеличава, а след това намалява с течение на времето при нискотемпературна обработка (Фигура 3 (b)). Активирането на каспаза-3 е свързано с намаляването на срязващата сила и митохондриалният път играе роля в скелетните мускули на говедата по време на след смъртта. [28, 29] Предишни проучвания за корелацията между катепсините и каспазите са неубедителни, поради което се предполага, че катепсините могат да бъдат в долната част на течението или нагоре по течението на активирането на каспазите и те могат да заместят каспазите или са напълно независими като палачи протеази. [30] Независимо от това, това проучване показва, че каспаза-3 е в долната част на CL в SJBW.

Съобщава се, че MAPK регулира увреждането на ДНК, както и активността на каспаза-3 в ядрените пулпозни клетки и клетките на човешкия рак на гърдата MCF-7. [31, 32] Значителното активиране на p38 и JNK в SJBW (Фигура 4) е в съответствие с доклад за Sarcophaga crassipalpis. [33] ERK обаче не е значително фосфорилиран в SJBW по време на нискотемпературна обработка. ERK фосфорилирането е замесено в клетъчната пролиферация и прогресията на клетъчния цикъл, докато p38 и JNK са по-често активирани в отговор на стрес и клетъчно увреждане. [34] Следователно, фосфорилирането на ERK може да играе роля на защитен сигнал срещу апоптоза при SJBW. Независимо от това, тези резултати показват, че p38 и JNK допринасят за промяната в качеството на SJBW.

Приносът на свръхпроизводството на ROS за нараняване в клетките вече е докладван. [35] Въпреки че подробните механизми, свързани с деградацията на текстурата в SJBW, остават неясни, доказателствата досега предполагат участието на ROS в увреждане на клетките. Например, UVB-индуцираната ROS насърчава апоптозата, придружена от MAPK активиране в ембриони от морски таралежи и индуциран от ROS топлинен стрес в целомоцити на Eisenia hortensis. [36, 37] По същия начин нашите резултати показват, че нискотемпературната обработка води до образуване на свободни радикали, както се наблюдава в ESR спектрите (Фигура 5). Редица проучвания съобщават, че свръхпроизводството на ROS е вредно за нормалния метаболизъм и предизвиква липидна пероксидация, разграждане на протеини и увреждане на ДНК. [38] Топлинният стрес стимулира производството на ROS и разграждането на протеини в скелетните мускули при 37 ° C. [39] Индуцираното от ROS увреждане на ДНК е наблюдавано по време на топлинен стрес. [40] Открихме, че нискотемпературното нагряване генерира голямо количество ROS за 1 h, когато се активират поредица от важни сигнални протеини като p38. Детайлната сигнална каскада на ROS индуцирана от ендоензим текстура остава да бъде изяснена.

Заключение

Нискотемпературно третиране на SJBW при 37 ° C, индуцирано образуване на ROS, фосфорилиране на MAPK, разграждане на протеини, регулирано от CL активиране, както и увреждане на ДНК и активиране на каспаза-3. Производството на ROS е най-ранното събитие. Въпреки че трябва да бъде допълнително проучено как ROS и сигнализацията надолу по веригата влияят върху структурата на SJBW по време на нискотемпературна обработка. Потенциално тези открития могат да доведат до подобрена обработка на морска краставица, за да се получат по-добри продукти с по-постоянно качество.