Партньорство USDA/ARS Детски изследователски център за хранене, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас, Съединени американски щати

изобилна

Партньорство USDA/ARS Детски изследователски център за хранене, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас, Съединени американски щати

Принадлежност USDA/ARS Детски изследователски център за хранене, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас, Съединени американски щати

Партньорство USDA/ARS Детски изследователски център за хранене, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас, Съединени американски щати

Принадлежности USDA/ARS Детски изследователски център за хранене, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас, Съединени американски щати, Център за подобряване на зеленчуците и плодовете, Тексаски университет A&M, College Station, Тексас, Съединени американски щати

  • Джиан Ян,
  • Лиза М. Фермер,
  • Abia A. A. Agyekum,
  • Исмаил Елбаз-Юнес,
  • Кендал Д. Хирши

Фигури

Резюме

Цитат: Yang J, Farmer LM, Agyekum AAA, Elbaz-Younes I, Hirschi KD (2015) Откриване на обилна растителна малка РНК при здрави потребители. PLoS ONE 10 (9): e0137516. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137516

Редактор: Maoteng Li, Huazhong университет за наука и технологии, КИТАЙ

Получено: 30 април 2015 г .; Прието: 18 август 2015 г .; Публикувано: 3 септември 2015 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейния поддържащ информационен файл.

Финансиране: L.M.F. беше подкрепена с безвъзмездна помощ от NIH (5T32HD071839-02). Тази работа беше подкрепена от USDA/ARIS 6250-51000-051-00D и средства от Програмите за изследвания на здравето на соята и сухия боб.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Малките РНК се съдържат в многобройни растителни храни, а някои показват перфектно допълване към човешките гени [8]. Доклад, предизвикващ множество парадигми, предполага, че погълнатите растителни miRNAs се прехвърлят в кръвта, натрупват се в тъканите и регулират ендогенната генна експресия при животните [9]. Впоследствие се съобщава за различни нива на успех по отношение на откриването на екзогенни диетични miRNAs при консуматори на бозайници [10-16]. Към днешна дата малките РНК на растителна основа са трудни за откриване в серумите на потребители, хранени с една порция храна [15, 17].

Материали и методи

Изследвания върху животни

IACUC на Медицинския колеж Baylor одобри проучвания за хранене на мишки и всички други експериментални процедури. Всички мишки са получени от Центъра за сравнителна медицина към Медицинския колеж Baylor. Мъжки ICR мишки на възраст от 8 до 10 седмици бяха използвани във всички проучвания за хранене, които бяха повторени поне три пъти; показаните резултати са представителни за биологичните повторения. Билкови и цветни диети за мишки бяха приготвени от фино смлени растителни тъкани, получени от различни местни китайски билкови магазини и тоници. Растително-чау диетите се приготвят чрез смесване на фино смлян чау, растителен материал и вода в тегловно съотношение 2: 1: 2. Амоксицилин (50 mg/kg/ден) и Trimethoprim Sulfa (TMS) (160 mg/kg/ml) се прилагат в питейната вода въз основа на предположението, че мишките пият по 5 ml вода на ден [21]. Инжекциите на опашната вена се правят съгласно стандартни протоколи [22]; 50 fmol от всяка РНК се ресуспендира в 100 μl фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и се инжектира в страничната вена на опашката. Синтетичните miRNAs са получени от Integrated DNA Technologies. Антибиотиците са получени от Sigma.

Събиране на серум и урина и екстракция на РНК

Кръв се събира чрез ретро-орбитално кървене от мишки и се оставя да коагулира при стайна температура в продължение на 1 час преди изолирането на серумите. Серумите се разделят чрез центрофугиране при 800 х g за 10 минути при стайна температура, последвано от центрофугиране при 10 000 х g при 4 ° С в продължение на 10 минути за отстраняване на всички кръвни клетки и остатъци. Чисти проби от урина, без изпражнения, бяха събрани чрез задържане на мишки над парафилм и насърчаване на микцията [23]. Общата РНК беше извлечена от 100 μL серуми или 80 μL урина, използвайки miRNeasy Mini Kit от Qiagen, следвайки препоръките на производителя. За проби от урина се добавя 1 pmol синтетичен MIR161 като екзогенен РНК контрол.

Анализ на нивата на miRNA чрез qRT-PCR

Taqman микроРНК тестове за let-7dgi [24], miR-16, MIR161, MIR2911, MIR156a, MIR168a и изкуствена miRNA C7 са получени от Life Technologies. Обща РНК, еквивалентна на 10 μL серуми или 8 μL урина, бяха използвани във всяка реакция на обратна транскрипция (RT). От 10 μL RT продукт, 0,5 μL се използва за всяка тройна количествена количествена полимеразна верижна реакция (PCR). За количествено определяне на нивата на miRNA в билките и цветята, 10 mg изсушен растителен материал се смилат до фин прах в течен азот и след това се подлагат на RNA изолиране с помощта на miRNEASY комплект (Qiagen); 1 pmol синтетичен MIR161 се добавя в растението Qiazol lysate като екзогенен РНК контрол. qRT-PCR беше извършена с помощта на Biorad CFX96 система за откриване на PCR в реално време и данните бяха анализирани с помощта на софтуер Biorad CFX. Методът Delta-Delta-Ct се използва за изчисляване на относителните нива на miRNAs. Абсолютните концентрации на miRNAs бяха изчислени въз основа на стандартни криви, получени от серийни разреждания на синтетични miPHK. За да се провери верността на комплекта за анализ на Taqman microRNA за MIR2911, продуктът qPCR е пречистен от агарозен гел и субклониран в pGEM-T Easy вектор (Promega) и секвениран [25].

Приготвяне на синтетични miRNAs

Синтетичните miRNAs са получени от Integrated DNA Technologies. Последователността на miRNAs беше следната: MIR-2911 5’-GGCCGGGGGACGGGCUGGGA-3 ’; MIR-168a 5’-UCGCUUGGUGCAGAUCGGGAC-3 ’; MIR168a * 5’-CCCGCCUUGCACCAAGUGAAU-3 ’; C7 5’-GGAUCAUCUCAAGUCUUACGU3 ’; C7 * 5’-ACGUAAGACUUGAGAUGAUCC-3 ’; MIR156a 5’- UGACAGAAGAGAGUGAGCAC-3 ’; MIR161 5’- UCAAUGCAUUGAAAGUGACUA-3 ’(звездичка означава пътническа верига). За хранене със сонда, miRNAs се разреждат в PBS без RNase и всяко животно се захранва с 400 pmols от всяка miRNA в 500 μL обем. За инжектиране на опашна вена, miRNAs се разреждат по подобен начин в PBS, като всяка мишка получава 50 fmols в 100 μL обем.

AGO2 Имунопреципитация

За имунопреципитация 250 μl от всяка проба от серуми се инкубира за една нощ при 4 ° C с 3 μg миши моноклонални анти-AGO2 антитела (Santa Cruz Biotechnology), последвано от имунопреципитация с 25 μl протеинови L агарозни мъниста (Santa Cruz Biotechnology) за 4 часа при 4 ° С. След пречистване, РНК се екстрахира от имунопреципитати и несвързани фракции с помощта на miRNeasy Mini Kit (Qiagen) и 1 pmol синтетичен MIR161 се добавя към Qiazol лизатите като екзогенен РНК контрол. Нивата на miRNA се определят количествено чрез qRT-PCR, като се използват TaqMan микроРНК анализи, както е описано по-горе.

Култивиране на фекални бактерии

Мишият фекален материал се претегля и хомогенизира в 1Х PBS до концентрация от 0,1 g/mL [26]. След това фекалните хомогенати бяха серийно разредени и поставени върху Luria-бульонни плаки без селекция. Плаките се инкубират при 37 ° С през нощта, броят на колониите след инкубацията се изчислява и се изчислява приблизителният брой бактерии на грам изпражнения.

Анализ на пропускливостта на FITC-декстран

Чревната пропускливост се оценява чрез орално приложение на FITC-декстран 4000 (Sigma). Храната и водата бяха изтеглени за 4 часа и впоследствие мишките бяха дадени с разтвор на FITC-декстран (60 mg/100 g телесно тегло). Серумът се събира 4 h след хранене и измерванията на FITC-декстран се извършват в два екземпляра чрез флуорометрия (възбуждане, 490 nm; емисия, 530 nm; Cytofluor 2300, Millipore). За изчисляване на стандартна крива бяха използвани серийни разреждания на FITC-декстран в PBS.

Лекарствено приложение

Цисплатин (Pfaltz и Bauer) се разтваря в стерилен 0,9% физиологичен разтвор при концентрация 1 mg/ml. На мишките беше приложена еднократна интраперитонеална инжекция или физиологичен разтвор, или цисплатин (15 mg/kg телесно тегло).

Статистически анализ

Статистически анализи бяха извършени с формулата за студентски T-Test в Microsoft Excel. Значението е определено в P Таблица 1. Съдържание на MIR2911 в различни билки и цветя.

Количествено определяне на нивата на MIR2911 в различни сушени билки и цветя. Изчисляването на концентрацията на MIR2911 се основава на стандартна крива и нормализиране на екзогенния добавен MIR161.

Циркулиращи нива на растителен MIR2911 при животни, хранени с билкови диети

Използвайки модифицирана диета на основата на чау, допълнена със смлени билки или цветя, ние анализирахме нива на MIR2911, получени от растения в серумите и урината на мишки седем дни след започване на храненето. Разликите в нивата на циркулиращ MIR2911 при билкови животни, хранени с диета, са следните: орлови нокти, 39 пъти по-високи (207 fM); лайка, 27 пъти по-висока (147 fM); софора, 22 пъти по-висока (120 fM); лавандула, 13 пъти по-висока (71 fM); син слез, 12 пъти по-висок (64 fM); женшен, 5 пъти по-висок (25 fM). Не се открива значителна промяна нито в хибискус (3 fM), нито в кора от върба (6 fM). Разликите в нивата на MIR2911 в пробите от урина на мишки, хранени с билкови диети, в сравнение с чау, са както следва: орлови нокти, 160 пъти по-високи (264 fM); лайка, 82 пъти по-висока (135 fM); лавандула, 17 пъти по-висока (28 fM) (Фигура 1). За да се провери точността на комплекта за анализ на qRT-PCR за MIR2911 със серумни проби, които имат относително малки количества MIR2911, продуктът qPCR беше субклониран и секвениран. Потвърждава се присъствието на пълната последователност на зрял MIR2911 в ампликона qPCR.

(А) Откриване на MIR2911 в серуми от мишки, хранени с различни билкови и цветни диети. (Б) Откриване на MIR2911 в урина от мишки, хранени с различни билкови и цветни диети. За (А) и (В) мишките са хранени с диети в продължение на 7 дни, преди РНК да бъде изолирана от проби от серум и урина и анализирани. N = 5. Звездичка: p Фиг. 2. Анализ на времевия ход на абсорбцията на синтетичен MIR2911, подаван със сонда, Анализ на времевия ход на нивата на серумен MIR2911 при мишки, хранени с 400 pmols синтетичен MIR2911 на 0,5 часа, 1 час, 3 часа след хранене със сонда.

Мишките бяха предварително хранени с чау диета. N = 5. Експериментът е повторен три пъти.

Оценка на връзката на серума MIR2911 с AGO2

Циркулиращите малки РНК са устойчиви на активност на RNase, екстремни колебания на pH и температура [27]. Един от механизмите за тази защита е свързването с РНК-свързващ протеин като Argonaute 2 (AGO2) [6, 28]. Изследвахме серумите, за да определим дали MIR2911 е свързан с AGO2 чрез извършване на ко-имунопреципитация с антитела срещу AGO2. Имунопреципитацията демонстрира, че приблизително 99% от MIR2911 не е свързан с AGO2 и остава във несвързаната фракция, докато ние възстановяваме приблизително равни концентрации на ендогенен miR-16 в имунопреципитатите и несвързаната фракция на серуми от хранени с билки животни и контролни мишки ).

(A) Количествено определяне на MIR2911 в свързани с AGO2 имунопреципитати и несвързани фракции на серума от животни, хранени с диета на основата на билки или стандартна диета с чау. (B) miR-16 имунопреципитацията се анализира като ендогенен контрол за валежите AGO2. Нивата на MIR2911 и miR-16 бяха нормализирани до екзогенен MIR161 с добавена шип. Този експеримент е представителен за повече от пет различни експеримента, направени с мишки, хранени с билки (орлови нокти, лайка).

Разчистване на циркулиращи малки РНК на растителна основа

In vivo доставянето на малки РНК е изправено пред много предизвикателства, включително ограничена стабилност в серума и бърз кръвен клирънс [29]. Нашите данни показват, че диетичният MIR2911 се стабилизира в серуми, без да се свързва AGO2 (Фигура 3). Може ли вторичната структура на MIR2911 да осигури защита от активността на RNase в серумите? За да тестваме това схващане, тествахме изчистването на синтетични растителни малки РНК директно от циркулацията. Коктейл от четири различни растителни малки РНК (MIR2911, MIR168a, MIR156a и MIR161) и специално проектиран siRNA MIRC7 бяха директно инжектирани във вената на опашката на мишката и серумите бяха събрани от мишките за 5 минути, 30 минути, 1 час, 3 часа и 24 часа след инжектирането. Концентрацията на интравенозната доза се основава на концентрациите на обилни циркулационни miRNAs като miR-16 [19]. Както много предишни доклади са документирали [29, 30], изчистването на тези малки РНК е бързо. Интересното е, че нивата на MIR2911 са значително по-високи на 5 минути след инжектирането в сравнение с другите miRNAs, прилагани при равни дози. След 3 часа привидният клирънс на всички тествани малки РНК е завършен (Фигура 4).

Анализ на хода на времето на серумните нива на микроРНК след инжектирането на микроРНК коктейл (5 pmol всеки) през страничната вена на опашката. 1Х PBS се инжектира като контрола. Експериментът е повторен повече от три пъти.

Влияние на чревния микробиом върху абсорбцията на MIR2911

Анализ на серумните нива на MIR2911 при мишки, хранени с орлови нокти (HS), мишки, хранени с орлови нокти и лекувани с антибиотици (HS + Ab), и мишки, хранени с чау. Мишките бяха хранени с диетите в продължение на 7 дни преди анализ на серумните нива на MIR2911. N = 5. Експериментът се възпроизвежда повече от три пъти с всяка диета и състояние.

Количествено определяне на чревната пропускливост при животни, хранени с орлови нокти

За да изследваме потенциални чревни промени, причинени от хранене с орлови нокти, които могат да потенцират усвояването на малки РНК, ние използвахме неметаболизиращата се макромолекула FITC-декстран 4000 като сонда за пропускливост [32]. Целостта на чревната епителна бариера при животни, хранени с орлови нокти, се оценява чрез хранене на мишки със сонда с 4 kD FITC-декстран молекула и измерване на нейното преместване в циркулация. Не открихме разлика в пропускливостта на FITC-декстран при животни, хранени с орлови нокти, в сравнение с животни, хранени с чау. Лечението с цисплатин се използва като положителен контрол за повишена пропускливост, тъй като е известно, че този химикал насърчава повишената пропускливост на червата [33] (Фигура 6).

Тематични области

За повече информация относно предметните области на PLOS кликнете тук.

Искаме вашите отзиви. Имат ли смисъл тези предметни области за тази статия? Щракнете върху целта до неправилната тема и ни уведомете. Благодаря за вашата помощ!

Е тематичната област "Диета" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "МикроРНК" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Билки" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Пропускливост" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Урина" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Микробиом" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Малка интерферираща РНК" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Цветя" приложим за тази статия? да не