Показатели: PDF 1284 показвания | Пълен текст 1058 преглеждания | ?

оксалатът

Марсия Конвенто _, Едсън Песоа, Алеф Арагао, Нестор Шор и Фернанда Борхес

Резюме

Марсия Конвенто 1, Едсон Песоа 1, Алеф Арагао 2, Нестор Шор 1 и Фернанда Борхес 1, 2

1 Нефрологичен отдел, Катедра по медицина, Федерален университет в Сао Пауло, Сао Пауло, SP, Бразилия

2 Интердисциплинарна следдипломна програма по здравни науки, Universidade Cruzeiro do Sul, Сао Пауло, SP, Бразилия

Ключови думи: епителен към мезенхимен преход; остеогенна диференциация; оксалат; TGF-р1; бъбречна медула

Получено: 25 юли 2018 г. Прието: 12 януари 2019 г. Публикувано: 01 февруари 2019 г.

ВЪВЕДЕНИЕ

Оксалатът (Ox) е редовен страничен продукт на метаболизма и произведените малки количества обикновено се отделят безвредно с урината. Независимо от това, повишената екскреция на оксалат (Ox) с урината в резултат или на генетични (първична хипероксалурия), и на фактори на околната среда (идиопатична хипероксалурия), поглъщане на богати на оксалати храни (вторична хипероксалурия), малабсорбция на мазнини поради хирургична операция за байпас и съвременна стомашна байпас ( ентерична хипероксалурия) [1, 2] може да доведе до уролитиаза, нефрокалциноза, пиелонефрит, хидронефроза, фиброза и бъбречна недостатъчност [3, 4].

Разработени са многообразни животински модели за изследване на хипероксалурия и нейните последици. В индуцирания от етилен гликол [5] и HPL [3] модел на животни с хипероксалурия е установено сериозно увреждане на тубулоинтерстициалната област. Тези лезии се характеризират с тубулна епителна клетъчна некроза, кристални отлагания на калциев оксалат в тръбни лумени и възпалителни инфилтрати, липидна пероксидация и пролиферация на резидентни интерстициални клетки, като фибробласти, а също и чрез увеличаване на компонентите на извънклетъчния матрикс, включително колагенови влакна [1, 6–8].

Доказано е, че оксалатът е токсичен в бъбречните епителни клетки с кортикален произход [9–13]. Клетките на вътрешния медуларен канал за събиране (IMCD), които са физиологично изложени на по-високи концентрации на оксалат, могат да се държат по различен начин. Тези клетки оцеляват в уникална среда в организма, често изложени на смъртоносни крайности на осмолалност, рН и токсини. Марони и др. [14], демонстрира, че свински проксимални тубуларни клетки (LLC-PK1) и човешки бъбречни проксимални тубуларни клетки (HK-2) са значително наранени при по-ниски концентрации на натриев оксалат в сравнение с IMCD клетки. Освен това, Брейди и др. [15], предполага, че HK-2 клетките са по-чувствителни от IMCD клетките към цитотоксичността на цисплатина инвитро, потвърждавайки идеята, че IMCD клетките са относително по-устойчиви на токсичност. Независимо от това, IMCD клетките може да не са инертни към оксалатни ефекти и биха могли да участват в нефролитиаза чрез фенотипни преходи и остеогенни придобиващи характеристики, както наскоро беше показано при хипероксалурични мишки in vivo [16].

Друго проучване на нашата група демонстрира, че експозицията на оксалатни йони към човешки проксимални тубуларни епителни клетки (HK-2) стимулира епителния тип 2 към мезенхимален преход (ЕМТ) [17].

ЕМТ от тип 1 се появява по време на нормална органогенеза. EMT от тип 2 е свързан със зарастване на рани, регенерация на тъканите и фиброза на органите. EMT от тип 3 е свързан с неопластичните клетки, които могат да мигрират в околните тъкани и да нахлуят в местата на метастази [18–20].

EMT от тип 2 е съществена проява на пластичност на епителните клетки по време на регенерация на тъканите и фиброза на органи, тя е свързана с реакции на възстановяване на тъканите, като фиброза, на основните увреждания в органите. При бъбречна фиброза, ако нараняването е леко и остро, лечебният процес се разглежда като репаративна фиброза; напротив, при продължаващо хронично възпаление, анормално образуване на миофибробласти, характеризиращо се с повишена подвижност, синтез на извънклетъчен матрикс протеин, пролиферация и инвазивност [18–20].

Загубите на експресия на маркери на епителни клетки се появяват едновременно с и като двигател на тези промени. Архитектурата и постоянството на епителните клетки, при запечатването на плътни връзки, зависят от контактите на клетъчни клетки, съдържащи Е-кадхерин. Освен че поддържат клетъчно-клетъчната адхезия, кадхерините могат да повлияят на широк спектър от клетъчни функции, които включват активиране на клетъчните сигнални пътища, регулиране на цитоскелета и контрол на клетъчната полярност [18–20].

Трансдиференцираните епителни клетки губят дефинираните си контакти между клетъчно-клетъчните мембрани и структурно-функционалната си полярност, за да станат вретеновидни и морфологично подобни на активираните фибробласти, има мезенхимни маркери, изразени в тип 2 EMT, като α-SMA, който се счита за микрофиламент маркер на миофибробласт. Друг показан мезенхимен маркер е Vimentin, междинна нишка, чиято експресия е пряко свързана с клетъчни фенотипни промени [18–20].

Смята се, че тип 2 EMT се появява в отговор на някакъв стресиращ стимул от околната среда като механично разтягане [21], токсичност при третиране с циклоспорин [22], излагане на напреднали гликационни крайни продукти (AGE-последица от хипергликемия) [23] и оксидативен стрес [ 24].

Доказано е, че някои разтворими растежни фактори, цитокини и извънклетъчни протеини влияят на EMT тип 2 и влияят върху прогресията на бъбречните заболявания. Трансформиращият растежен фактор бета (TGF-β1) обаче изглежда играе видна роля, с нарастване на експресията почти универсално при прогресиращи форми на бъбречно заболяване [25, 26]. Всъщност TGF-β1 може да индуцира генетична програма за клетъчна пластичност, която включва ключови пътища и регулатори на дедиференциация на епитела, реорганизация на цитоскелета и пролиферация. TGF-β1 индуцира експресия на фиброзни гени и медиира гломерулна и тубуларна клетъчна апоптоза, механизмът, чрез който тубуларните епителни клетки могат да придобият миофибробластичен фенотип, който е от съществено значение за патогенезата на фиброзата [27–29].

EMT тип 2 вече е демонстриран в IMCD клетки инвитро, чрез експозиция с рецептор на епидермален растежен фактор [30], Bestrophin-1 [31], TGF-β1 [32], инсулиноподобни растежни фактори [32] и фактор за диференциация на растежа-11 [27]. In vivo експериментите показаха, че вродената обструкция на пикочните пътища при хора [33] и животни [34] при увреждане на епителните клетки на колекторния канал и EMT от тип 2. Индукцията на оксалат от EMT от тип 2 в медуларния събирателен канал, който не произхожда от мезенхимален метанефрен, а от уретерална пъпка, не е демонстрирана.

Хипероксалуричните плъхове повишават мезенхимните маркери и остеогенните маркери, както в бъбречната кора, така и в медулата [16]. По този начин, това проучване предполага, че оксалатните йони могат да индуцират TEM тип 2 в IMCD клетки и че тези трансформирани клетки могат да бъдат стимулирани да експресират остеогенни маркери инвитро. Ефектите на оксалат in vivo върху бъбречната медула на мишки също ще бъде оценена.

РЕЗУЛТАТИ

За да определим дали IMCD клетките, изложени на Ox и TGF-β1, са станали по-активни при инвазия от контролните клетки, ние оценихме тази характеристика на мезенхимната клетка, използвайки анализа на трансуелната камера.

Както е показано на Фигура 1А, IMCD клетките, изложени на Ox 0,5 mM (0,246 ± 0,003 DO) и TGF-β1 20 ng/mL (0,285 ± 0,006 DO), навлизат през порите по-бързо от контролните клетки (0,132 ± 0,005 DO). Придобиването на способност за клетъчна инвазия е характеристика на TEM тип 2. Групата Ox (0,5 mM) придобива тази способност, както и стимулираната TGF-β1 група (положителен контрол), която се счита за основен медиатор на TEM тип 2 [35, 36]. Вземайки го предвид, тези групи останаха в нашия модел на изследване.

Приготвяне на оксалатни йони

Разтвори на дикалиев оксалат (0,4 М, 100 мл) (Merck, Дармщат, Германия) се добавят към 300 мл дестилирана, дейонизирана вода при постоянна скорост на капене от 1 мл/мин за 2 часа. Тази суспензия се разбърква непрекъснато в продължение на 5 часа при 75 ° С и след това се промива с дейонизирана вода за отстраняване на калиев хлорид. Оксалат (10 тМ) се добавя към буфериран с фосфат физиологичен разтвор (калций без PBS), стерилизира се в 0.22 цМ филтър и се използва в съответните протоколи при концентрация от 0.5 тМ (48 часа). В допълнителната фигура 1 клетките са изложени на 1.0 Mm (48 часа), но не е използвано в нашето проучване.

Излагане на IMCD обезсмъртени клетки на оксалатни йони (0.5 mM), екзогенен TGF-β1 (20 ng/mL) и NAC (10 mM)

Преди експериментите, обезсмъртени клетки (американска колекция от култури (ATCC)) се поддържат в условия на култивиране в продължение на 2 дни. При сливането IMCD бяха изложени за 48 часа на DMEM (5% FBS, контрол), DMEM, съдържащ оксалат (0,5 mM), TGF-β1 (20 ng/ml, Peprotech, NJ, US), използвани като положителен контрол от типа 2 ТЕМ и N-ацетилцистеин (10 Mm, Sigma, Сейнт Луис, МО, САЩ). Експерименталният протокол се повтаря най-малко 3 пъти през различни периоди. н = 5 за всяка група.

Анализ за инвазия

IMCD инвазията се анализира чрез анализ на транс-ямка; 10 5 клетки бяха добавени към горните камери на 6-ямкови плазми с ямки (размер 8 μm, Millipore Corporation, Bilerica, МА, САЩ) и среда, съдържаща 5% FBS с Ox и TGF-β1, беше добавена към долните камери за 48 ч. Горните (неинвазивни) клетки бяха отстранени, долните (инвазивни) клетки бяха фиксирани във формалдехид 3.7%, оцветени с Trypan Blue, разтворени в натриев додецил сулфат (2%) и абсорбцията беше регистрирана при 620 nm. Всички тези анализи са направени в три екземпляра.

Имунофлуоресценция

IMCD клетки се отглеждат на стъклени стъкла Labtek II с 8 ямки, след това се измиват с PBS, фиксират се (3.7% пресен параформалдехид в PBS за 20 минути при стайна температура), пермеабилизират (0.5% Triton X-100 за 5 минути), блокират с 5 % физиологичен разтвор, буфериран с албумин/фосфат (BSA/PBS) за 60 минути. След блокиране, първични моноклонални антитела на плъхове (Santa Cruz). 1:50 към E-кадхерин, α-SMA и Vimentin бяха добавени за една нощ при 4 ° С в 0.5% BSA/PBS. Белязаните с FITC вторични анти-плъхови IgG и анти-миши IgG (1: 100) (Санта Круз) бяха добавени за 2 часа при стайна температура в 0.5% BSA/PBS и клетките бяха инкубирани с DAPI (4′6-диамидино- 2-фенилиндол, Sigma) 10 μg/mL. Покривните стъкла се монтират върху стъклени стъкла с буфериран глицерин и се анализират с помощта на флуоресцентна микроскопия Nikon. Получените микроскопски изображения са количествено определени с помощта на софтуера ImageJ. Данните се отчитат като процент от положителната интензивност на флуоресценция на площ [62].

Анализ на миграцията

Тестът за зарастване на рани обикновено се използва за оценка на ефекта на про и антимиграционните агенти върху култивираните клетки [63]. Накратко, клетките се отглеждат до сливане в пластмасови съдове с култура до плътност приблизително 5 × 106 клетки/ямка. След 24 часа престой клетките бяха обелени, като влачеха гумен полицай през центъра на плочата. Културите се изплакват с PBS и се заменят с прясна среда, съдържаща 5% FBS (контролна ситуация), а среда, съдържаща 5% FBS, добавя Ox (0,5 mM) и TGF-β1 (20 ng/ml), след което IMCD клетките се инкубират при 37 ° C за 48 часа и снимано.

Полимеразна верижна реакция в реално време (PCR в реално време)

Общата рибонуклеинова киселина (РНК) се пречиства (IMCD клетки и мозъчен бъбрек на мишки) чрез метод на фенол и гуанидин изотиоцианат-цезиев хлорид, като се използва подходящ комплект (Trizol, Life Technologies, USA). 2 микрограма обща РНК бяха третирани с DNase (RQ1 без RNase DNase, Promega), за да се предотврати замърсяването на геномна дезоксирибонуклеинова киселина. РНК пелетата се ресуспендира във вода без RNase. Обратна транскрипция в cDNA чрез добавяне на смес, съдържаща 0,5 mg/ml олиго d (T), 10 mM DTT, 0,5 mM dNTPs (Pharmacia Biotech) и 200 U ензим за обратна транскриптаза (SuperScript RT, Gibco-BRL). Амплификацията в реално време се получава, като се използва система за откриване на последователност GeneAmp 7700 (SDS, ABI Prism 7700, Applied Biosystems) и се наблюдава с помощта на SYBR Green I интеркалиращо багрило (Applied Biosystems). PCR се извършва със селективни праймери (допълнителна таблица 1). Резултатите са докладвани като относителна експресия, нормализирана с гена за поддържане на β-актин. Вариацията на гънките се определя по метода 2- (ΔΔCt) съгласно предварително публикуван протокол [64].

Анализ за остеоиндукция

IMCD клетките бяха изложени в продължение на 48 часа или на DMEM (5% FBS, контрол), DMEM, съдържащ оксалат (0.5 mM) и TGF-β1 (20 ng/mL). След този период клетките бяха изложени в остеогенна кондиционирана среда, включваща α-MEM с 5% FBS, 50 μg/ml аскорбинова киселина (Gibco), 10 mM b-глицерол-фосфат (Gibco) и 10 nM дексаметазон (Sigma), за 15 дни култура с ежедневна смяна на остеогенна кондиционирана среда. Общата РНК (PCR в реално време) беше извлечена, за да се открие експресията на остеогенни маркери, свързан с Runt транскрипционен фактор 2 (RUNX-2) и алкална фосфатаза (ALP). На 15-ия ден се добавя оцветителят с извънклетъчна матрица (Alizarin Red S) върху плаките в култура и изображенията се снимат във всички групи.

Инвитро анализ на пероксидацията (реактивни вещества с тиобарбитурова киселина - TBARS)

Малодиалдехидът (MDA) се комбинира с тиобарбитурова киселина (TBA), образувайки червено съединение, чиято концентрация е оценена чрез спектрофотометрия с отчитане при 535 nm [65]. Културна среда без фенол и клетъчни хомогенатни проби от клетъчни култури се стимулират с оксалат (0,5 тМ) и TGF-р1 (20 ng/ml) в отсъствие и присъствие на NAC (10 тМ) в продължение на 48 часа. Добавката с NAC осигурява сулфтиолова група на L-цистеин и също така оказва антиоксидантен ефект чрез директно изчистване на свободните радикали. Клетъчните хомогенати се получават чрез бракуване на клетки от колбите с PBS. Пробите се добавят към разтвор от 0,375% TBA, 15% трихлороцетна киселина и 0,25 HCI (Sigma Chemicals), поддържат се при непрекъснато разбъркване, загряват се при 95 ° С в продължение на 20 минути и след това се охлаждат до стайна температура. Концентрацията на протеини беше проверена по метода на Lowry [66]. Положителен контрол се получава чрез инкубиране на клетъчните проби с H2O2 при 1% за 1 h преди анализа. Резултатите бяха коригирани чрез протеина и бяха изразени като μM/mg.

Уестърн блотинг

Концентрацията на протеини беше проверена по метода на Lowry [66]. IMCD клетките се лизират с 200-μL RIPA лизисен буфер на плака (100 mm2). Лизатите се центрофугират при 12 000 g в продължение на 5 минути при 4 ° С и супернатантите се съхраняват при -80 ° С. Протеини (30 μg) се разделят чрез 10% полиакриламидна гел електрофореза и се прехвърлят в поливинилиден флуоридни мембрани с помощта на Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (BioRad). Неспецифичните места за свързване бяха блокирани с 5% BSA (v/v) в TBS буфер. Имуноблотите се инкубират една нощ при 4 ° С с първичните антитела TGF-β1 и GAPDH (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). След промиване три пъти с TBS-T, мембраните се инкубират в продължение на 1 час при 4 ° С в конюгирани с HRP вторични антитела (1: 30000; клетъчна сигнализация). Имунореактивните протеинови ленти бяха визуализирани с помощта на Pierce ECL Plus хемилуминесцентни субстратни детектиращи реагенти (Thermo Fisher, САЩ). Изображенията са получени и анализирани със система за документиране на хемилуминесценция Alliance 7 (UVItec, Кеймбридж, Великобритания). Интензитетите на имуноблот лентата бяха количествено определени с помощта на софтуера ImageJ и изразени като съотношение TGF-β1/GAPDH.

In vivo експериментални групи

Експерименталният протокол беше одобрен от Комитета по етика на Федералния университет в Сао Пауло (номер на протокола CEP 1098/10), също в съгласие с бразилските насоки за научни грижи и употреба на животните [67, 68]. Мишките C57Bl/6 бяха разделени на следните групи: контролна група, приемаща вода ad libitum за 60 дни; група HPL, която е получавала 5% HPL за 60 дни ad libitum. В края на експерименталния протокол след 60 дни мишките се държат в продължение на 24 часа в метаболитни клетки за събиране на урина и след това се умъртвяват с помощта на токсична доза анестетик (кетамин и ксилазин). Бъбреците бяха отстранени за хистологичен анализ. Обемът на урината беше измерен, за да се анализира екскрецията на оксалат. Експерименталният протокол се повтаря 3 пъти в различни моменти с н = 5 за всяка група.

Оксалат на урината

Беше анализиран с комплект за оксалатоксидаза (Trinity Biotech, Co. Wicklow, Ирландия), следвайки протокола на производителя. Резултатите се коригират чрез обема на урината и се изразяват като mMol/24 h.

Кристали в урината

Утайката от урина се получава чрез центрофугиране (2300 об/мин/мин за 5 минути) и се преброява в камера на Нойбауер, като се следва формулата: (краен обем × брой де кристали)/(първоначален обем × 0,0001) и се снима. Резултатите са изразени като уринарни кристали/mL.

Хистохимичен анализ

Парафиновите срезове бяха подложени на разтвори на ксилол и алкохол с градиент, възстановяване на извличане на антиген, протеинов блок и инкубация с първичен заешки анти-TGF-β1 (1: 100, Санта Круз, САЩ) за една нощ при 4 ° С. След този период срезовете бяха инкубирани с декстран полимер, конюгиран с пероксидазно антитяло в продължение на 30 минути (DAKO Envision kit, Dako, Дания). Маркирането беше открито чрез излагане на срезовете с използване на хромогенен субстрат. Първичното антитяло беше пропуснато като отрицателна контрола и срезовете бяха оцветени с хематоксилин и анализирани под светлинен микроскоп моделът Olympus BX 60 при увеличение 20x или 40x. Парафиновата част на бъбрека също беше оцветена с пикросириус в червено и количествено определена под поляризиран светлинен микроскоп (Olympus BX 60), за да се оцени производството на видове колаген (тип I жълт до червен тон и тип III зеленикав тон). Получените микроскопски изображения се определят количествено с помощта на софтуера ImageJ и се изразяват като% от оцветената площ.

Статистически анализ

Резултатите са изразени като средно ± SEM. Статистическият анализ беше извършен с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от post-hoc тест на Tukey, стр-стойности ->