Роли Куриране на данни, формален анализ, разследване, методология, визуализация, писане - оригинален проект

индуцирана

Affiliation School of Life Sciences, Arizona State University, Темпе, Аризона, Съединени американски щати

Концептуализация на роли, ресурси, писане - преглед и редактиране

Affiliation Isagenix International, LLC, Gilbert, Arizona, Съединени американски щати

Концептуализация на роли, Куриране на данни, Формален анализ, Придобиване на финансиране, Разследване, Методология, Администриране на проекти, Ресурси, Софтуер, Надзор, Проверка, Визуализация, Писане - оригинален проект, Писане - преглед и редактиране

Affiliations School of Life Sciences, Arizona State University, Tempe, Arizona, Съединените американски щати, College of Health Solutions, Arizona State University, Phoenix, Arizona, Съединените американски щати

  • Мели’са С. Крофорд,
  • Ерик Гъмприхт,
  • Karen L. Sweazea

Фигури

Резюме

Разпространението на метаболитния синдром (MetSyn) се е увеличило с 35% от 2012 г. насам и над две трети от американците проявяват характеристики, характеризиращи това състояние (затлъстяване, дислипидемия, хипергликемия, инсулинова резистентност и/или ендотелна дисфункция). Целта на това проучване е да се оценят ефектите на нов хранителен добавъчен органичен минерален комплекс (OMC) върху тези рискови фактори в модел на гризачи на MetSyn. Шестседмични мъжки плъхове Sprague-Dawley са били хранени или със стандартна чау, или с диета с високо съдържание на мазнини (HFD), съставена от 60% kcal от мазнини в продължение на 10 седмици. Плъховете също са третирани с OMC в питейната си вода или 0 mg/mL (контрола), 0.6 mg/mL, или 3.0 mg/mL. Третираните с HFD плъхове показват значително повишена телесна маса (p Таблица 1. Физични, химични и функционални характеристики на OMC.

Морфометрия

Телесната маса се измерва ежеседмично, за да се оценят промените в отговор на диетата и лечението с OMC. Дължината на носовия канал, дължината на опашката и обиколката на корема (непосредствено пред задния крак) бяха измерени с помощта на гъвкава рулетка в края на 10-седмичното проучване. След евтаназия се събира кръв чрез сърдечна пункция и плазмата се изолира и замразява при -80 ° C до употреба. Епидидималната мастна подложка се извлича от всяко животно, за да се оцени затлъстяването, както е описано по-рано [11]. Индексът на Лий за затлъстяване е изчислен като кубичен корен от телесна маса (g)/дължина на назоанала (cm)) x 1000 [15, 16].

Глюкорегулаторни променливи

Плъховете са били ограничавани чрез предоставяне на аликвотна част от храната (2g/плъх на изходно ниво и 4g/плъх на 6 и 10 седмица) в 18:00 ч. Вечерта преди вземането на кръв на гладно. Следващите сутрешни кръвни проби на гладно (300–500 μL) бяха събрани от вената на опашката на изходно ниво, седмици 6 и 10. След това серумът беше отделен от пълната кръв и съхраняван при -80 ° C до анализи. Концентрациите на глюкоза на гладно са измервани чрез метода на глюкозната оксидаза, като се използва търговски наличен комплект (Кат. № 10009582, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) съгласно протокола на производителя. Концентрациите на инсулин на гладно са измервани с помощта на наличен в търговската мрежа комплект (Cat. No. 90060, Crystal Chem, Elk Grove Village, IL). Количественият индекс за проверка на инсулиновата чувствителност (QUICKI) се изчислява като (1/(log инсулин (mU/L) + log глюкоза (mM/L)). QUICKI е валидирана сурогатна мярка за чувствителност към инсулин, използвана както в клинични проучвания, така и при животни [17, 18] Изследвания на плъхове показват, че QUICKI е по-добър индикатор за инсулинова чувствителност от HOMA-IR, тъй като не включва специфичен за човека нормализиращ фактор [17].

Биомаркери на оксидативен стрес и увреждане на хепатоцитите

Активността на плазмената супероксиддисмутаза (SOD) се измерва в края на изследването, като се използват търговски налични комплекти (Кат. № 706002, Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan). Концентрациите на водороден пероксид и креатинин в урината се измерват с помощта на налични в търговската мрежа комплекти (кат. № ab102500, Abcam, Cambridge, МА; кат. № CR01, Oxford Biochemical Research, Rochester Hills, MI). Активността на плазмените ALT и AST също бяха измерени в края на 10-седмичния протокол за хранене, използвайки налични в търговската мрежа комплекти (съответно кат. MAK052 и MAK055; Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

Количествено определяне на плазмените ендотоксини

Плазмените концентрации на липополизахариди се определят количествено с наличен в търговската мрежа комплект (Кат. № 88282, Thermo Fisher Scientific Rockford, IL) съгласно протокола на производителя.

Ендотел-зависима вазодилатация

Основни разтвори на ацетилхолин (ACh, 1.0 M, Sigma Aldrich) и фенилефрин (PE, 1.0 M, Sigma Aldrich) бяха приготвени в дейонизирана вода, аликвотирани и съхранявани при -20 ° C до употреба. След евтаназия е извършена лапаротомия по средната линия за отстраняване на мезентериалната аркада, която незабавно е прехвърлена в ледено студен HEPES буфериран физиологичен разтвор (в mM: 134,4 NaCl, 6 KCl, 1 MgCl2, 1,8 CaCl2, 10 HEPES и 10 глюкоза, pH 7.4 с NaOH). Аркадата беше закрепена в дисекционна чиния със силастично покритие и мезентериални резистентни артерии (

Дължина 1 мм; 126 ± 3 μm, i.d.) бяха изолирани и прехвърлени в съдова камера (кат. № CH-1, Living Systems Instrumentation, St. Albans, VT), съдържаща буфериран с HEPES физиологичен разтвор. След това изолираните артерии бяха канюлирани със стъклени пипети, закрепени с копринени лигатури и опънати надлъжно до приблизителна дължина in situ. След това съдовете бяха под налягане до 60 mmHg с помощта на серво контролирана перисталтична помпа (Living Systems Instrumentation) и камерата на съда се прехвърли на етапа на обърнат микроскоп Nikon за анализ. Съдовете непрекъснато се суперфузират с топъл (37 ° С) физиологичен физиологичен разтвор (PSS, в mM: 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH2PO4, 0,83 MgSO4, 19 NaHCO3, 1,8 CaCl2 и 5,5 глюкоза) със скорост 10 ml/min . PSS се аерира с газова смес, съдържаща 21% O2, 6% CO2, баланс N2 за поддържане на рН и оксигениране.

След 30-минутно уравновесяване на изолирани артерии в PSS, съдовете бяха предварително свити с нарастващи концентрации на PE в суперфузата, докато достигнат 50% от вътрешния си диаметър в покой. Ендотелиум-зависимата вазодилатация беше оценена чрез излагане на предварително стеснени артерии на постепенно увеличаване на ендотелий-зависимия вазодилататор ACh (10 -9 до 10 -5 M, 3 минути на стъпка) в суперфузат, последвано от разтвор без калций PSS (в mM: 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH2PO4, 19,0 NaHCO3, 5,5 глюкоза и 3 EDTA) за измерване на пасивния вътрешен диаметър. Интралуминалният диаметър (i.d.) се наблюдава непрекъснато от видеомикроскопия на изображения с ярко поле, използвайки система за откриване на ръба на съдовете с диаметър (IonOptix, Milton, MA, USA). Вазодилатацията се изчислява като процентно обръщане на ПЕ-медиирана вазоконстрикция.

Western blot анализи

статистически анализи

Всички данни са изразени като средни стойности ± SEM. Данните, събрани в множество точки от време (телесна маса, глюкоза, инсулин и вазодилатация, зависима от ендотел), бяха анализирани чрез двупосочни повторни мерки ANOVA с диета и доза OMC като фактори. Процентните данни бяха преобразувани в арксинус до приблизително нормално разпределение преди анализи. Всички останали данни бяха анализирани чрез двупосочен ANOVA с диета и доза OMC като фактори. Там, където са наблюдавани значителни ефекти, са използвани posthoc анализи на Tukey. Вероятността от ≤ 0,05 се приема като статистически значима.

Резултати

Морфометрия

Плъховете с HFD натрупват значително повече тегло в сравнение със съответните контроли, хранени с Chow (Фигура 1). По същия начин масата на епидидималната мастна тъкан, обиколката на талията и дължината на назоанала са значително увеличени при HFD плъхове в сравнение с контролите, въпреки че дължината на опашката не се различава между групите (Таблица 2). Индексът на Lee за затлъстяване на Lee не се различава значително между плъхове с HFD и хранене с чау, което показва, че плъховете са просто с наднормено тегло за разлика от затлъстяването (Таблица 2). OMC не повлиява нито една морфометрична променлива (Фигура 1, Таблица 2).

Плъховете са били хранени или (A) със стандартна храна за гризачи, или (B) с 60% kcal от диета с високо съдържание на мазнини (HFD) в продължение на 10 седмици. Данните са изразени като средна стойност ± SEM. Данните бяха анализирани от двупосочен RM ANOVA (SigmaStat 3.0, Systat Software, Сан Хосе, Калифорния). *p Таблица 2. Морфометрия на десет седмици.

Глюкорегулаторни променливи

Плъховете развиват значителна хипергликемия след 6 и 10 седмици HFD (p Таблица 3. Биохимични параметри на гладно.

Биомаркери на оксидативен стрес

Активността на SOD в плазмата е значително по-висока при плъхове Chow, третирани с 0,6 mg/ml OMC, в сравнение с плъхове, хранени с HFD, лекувани със същата доза (р = 0,047; Фигура 2А). Тази разлика вероятно се дължи на повишаването на активността на SOD при животните от чау. Не са наблюдавани други промени в активността на SOD. Плъхове, хранени с HFD без лечение с OMC, имат значително повишени концентрации на H2O2 в урината в сравнение с нелекувани животни, хранени с Chow (р = 0,032). Концентрациите на H2O2 в урината не са повлияни от OMC (Фигура 2В).

(A) Активност на плазмената супероксиддисмутаза (SOD) и (B) концентрации на водороден пероксид в урината (H2O2), нормализирани към креатинин в урината. Данните се изразяват като средна стойност ± SEM и се анализират чрез двупосочен ANOVA, n = 6–10 на група за плазма и n = 4–8 на група за урина. *p Фигура 3. Концентрации на плазмен липополизахарид (LPS).

Данните се изразяват като средна стойност ± SEM и се анализират чрез двупосочна ANOVA, n = 6-10 на група. *p Фиг. 4. Плазмена активност на аланин аминотрансфераза и аспартат аминотрансфераза.

Активност на плазмените ALT (A) и AST (B) след 10-седмична диета. Данните са изразени като средна стойност ± SEM, n = 6-10 за група. Данните бяха анализирани чрез двупосочна ANOVA. #p Фигура 5. Зависима от ендотел вазодилатация на артериите от плъхове, хранени с Chow и HFD, лекувани с OMC.

Изолираните мезентериални резистентни артерии бяха предварително свити до 50% от вътрешния диаметър в покой, след което бяха изложени на нарастващи концентрации на ACh в суперфузата, за да се получи процентно обръщане на фенилефрин медиирана вазодилатация. Данните са изразени като средна стойност ± SEM. Данните бяха преобразувани в арксинус преди анализ чрез двупосочни повтарящи се мерки ANOVA за приблизително нормално разпределение. *p Фигура 6. Western blot анализи на експресията на eNOS и iNOS протеин в мезентериални артерии, изолирани от животни, хранени с Chow и HFD, лекувани с OMC.

А) Денситометрия на eNOS мономер (140 kDa) експресия на протеин. Б) Денситометрия на iNOS (130 kDa) експресия на протеин. Всички стойности на денситометрията бяха нормализирани спрямо контрола на натоварването с β-актин и изразени като съотношение на контролните стойности на Chow. Данните са показани като средна стойност ± SEM. Числата на графиките представляват размери на пробите (n). * p Изследванията на Met от нашата лаборатория потвърдиха, че храненето с HFD насърчава симптоми, съответстващи на последствията, свързани с MetSyn [11, 12] Например, HFD хранене на 6-седмични мъжки плъхове Sprague-Dawley увеличава телесната маса и коремното затлъстяване, нарушава ендотел-зависимата вазодилатация и повишава глюкозата на гладно. Подобни констатации са докладвани при плъхове Wistar [20, 21], като по този начин се поддържа независима от щама патологично сходство в този индуциран от диета модел на MetSyn.

Диетичните нитрати, получени от зеленчуци и плодове, все повече се признават за техните кардиопротективни ползи [27]. Тези ползи се дължат на понижаващите кръвното налягане ефекти, произтичащи от превръщането на хранителните нитрати в нитрити от перорални коменсални бактерии [27]. Всъщност се смята, че диетичните подходи за спиране на хипертонията (DASH) намаляват кръвното налягане отчасти чрез повишена консумация на плодове и зеленчуци, което води до концентрация на нитрати в храната между 174 и 1222 mg [27]. Въпреки че не се състои от пресни плодове или зеленчуци, анализите на OMC показват, че полученият от почвата комплекс съдържа 1230 ppm (mg/L) нитрати, което отчасти може да обясни подобрените реакции на вазодилатация при животни, хранени с HFD, третирани с OMC.

Нашите данни обаче не подкрепят антиоксидантната роля на OMC, тъй като добавките не са повлияли на тези нива. Интересно е, че оксидативният стрес не е смекчен от OMC, наблюдение, което може да предположи, че OMC подобрява патофизиологичните нарушения на индуцираните от HFD метаболитни нарушения чрез неантиоксидантно-зависими механизми. Въпреки че самата фулвокиселина демонстрира in vitro антиоксидантни свойства [36], нашият анализ на OMC разкри нисък общ резултат на ORAC.

Повишените нива на ROS като H2O2 са свързани с развитието на чернодробна стеатоза чрез пероксизомно бета-окисление на свободни мастни киселини [8]. Генерирането на ROS може да индуцира апоптоза на хепатоцитите, да стимулира възпалителен отговор и да увеличи активността на ALT, ключов показател за чернодробно увреждане [37]. Освен това, асоциативна връзка между чернодробно увреждане и ендотоксемия е съобщена от други. Например, Kai et al [38] наблюдават LPS инжекции, които влошават увреждането на черния дроб при плъхове, хранени с HFD, чрез механизми, повлияващи повишени рецептори, активирани с пероксизомен пролифератор (PPARs) и бета-окислителни ензими. Освен това, възпалителните гени се активират в адипоцитите чрез генерирането на свободни радикали [39]. Нашите колективни резултати както на хепатопротективния, така и на стомашно-чревния модифициращ ефект на OMC, наблюдавани в настоящото проучване, предполагат многостранни механизми, допринасящи за цялостните му ползи в този модел на MetSyn.

Ограничение на настоящото проучване бяха малките размери на пробите във всяка група, които може да имат ограничена интерпретация на резултатите. Ограниченията на ex vivo вазодилатационните проучвания включват липсата на измерване на независими от ендотел реакции на NO, като се използва донор на азотен оксид като натриев нитропрусид, както и измервания на ролята на оксидативен стрес в съдоразширяващия отговор при всяко лечение. Други ограничения на настоящото проучване включват изследване на отговорите само при мъжки гризачи и липса на данни за кръвното налягане, както и приема на храна.

В обобщение, настоящото проучване демонстрира OMC, нов и уникален извлечен от почвата продукт, предотвратява няколко от усложненията, свързани с метаболитна дисфункция, индуцирана от HFD. Предполагаме, че комбинацията от органични киселини, микроелементи, нитрати и минерален състав на добавката функционират колективно в тази защита чрез анти-антиоксидантни механизми.

Благодарности

Авторите благодарят на Уилям Кларк, Ашли Стар и Антъни Базил за техническа и животновъдна помощ. Авторите също така благодарят на Morgan Nelson за съдействието при анализа на Western blot.