Експериментално
и терапевтични
Лекарство

• Последните две години
• Обща сума

• Миналата година 0
• Обща сума

• Миналият месец
• Изминалата година
• Обща сума

• Yi Guo
• Юни i Сян Ли
• Танг-Ю Мао
• Wei ‑ Han Zhao
• Li ‑ Juan Liu
• Юн-Лианг Уанг

Тази статия се споменава в:

Резюме

Материали и методи

Приготвяне на GGQLD и ресвератрол (Resl)

GGQLD гранули са предоставени от Катедрата по фармация на болница Dongfang, Пекински университет по китайска медицина (Пекин, Китай). Гранулите се състоят от следните съставки от формулата на Gegen Qinlian: корен Kudzu, Rhizoma coptidis, Scutellaria baicalensis Georgi и основна сладка сладка сладка, съответно на 24, 9, 9 и 6 g. Resl е закупен от Zelangyiy Co., Ltd., (Нанкин, Китай).

Животни и лечение

Общо 30 мъжки плъхове Sprague-Dawley (на възраст 7 седмици; тегло 200 ± 20 g) са доставени от Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай). Всички експериментални процедури върху животни са одобрени от Комитета по етика на животните от Пекинския университет по китайска медицина съгласно указанията, издадени от Регламентите на Пекинското лабораторно управление на животните (18). Плъховете се поддържат на 12-часов цикъл светлина/тъмнина при постоянна температура (22 ± 2 ° C) и влажност 50 ± 10% с ad libitum достъп до стандартна чау диета (контролна група) или диета с високо съдържание на мазнини ( HFD; 34% мазнини, 19% протеини и 47% въглехидрати по енергиен състав; n = 6 на група) в продължение на 8 седмици за предизвикване на NAFLD. В допълнение, GGQLD гранулите и Resl се разтварят в 100 ml дестилирана вода и се съхраняват при 2–8 ° C до по-нататъшна употреба. Петте групи животни (n = 6) са лекувани орално в продължение на 8 седмици, както следва: GGQLD ниски и високи дози (GGQLD-L и GGQLD-H) групи, третирани съответно с 5.04 и 10.08 g/kg/ден GGQLD; Resl група, третирана с 400 mg/kg/ден Resl; и моделът HFD и контролните групи бяха третирани с 10 ml/kg/ден физиологичен разтвор в продължение на 8 седмици от началото. На групите GGQLD и Resl са приложени съответните лечения в началото на храненето с HFD, а контролата получава стандартната чау диета.

Определяне на метаболитните параметри и чернодробните ензими

В края на лечението животните се анестезират, използвайки 4% хлоралхидрат (Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd, Шанхай, Китай) след 12-часово бързо гладуване и се вземат кръвни проби от коремната аорта на плъхове. Серумните TG на гладно (Jing 20142401132), общият холестерол (TC, Jing 20162400910), липопротеиновият холестерол с висока плътност (HDL-C, Jing 20152400950) и холестеролът на липопротеините с ниска плътност (LDL-C, Jing 20142400518), както и серумът на гладно аланин аминотрансфераза (ALT, Jing 20142401158) и аспартат аминотрансфераза (AST, Jing 20142401158) са анализирани с помощта на ELISA комплекти (BioSino Biotechnology and Science, Inc., Пекин, Китай).

Хистологичен анализ

Парафиновите срезове на чернодробните тъкани се фиксират с 10% разтвор на формалдехид в продължение на 48 часа при стайна температура и тъканните резени (дебелина 4 µm) се приготвят за оцветяване с хематоксилин за 10 минути и оцветяване с еозин за 2 минути при стайна температура. Хематоксилин и еозин (H&E) са закупени от Beijing Zeping Bioscience & Technologies Co., Ltd. (Пекин, Китай). Оцветяването с маслено червено O (ORO; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Дармщат, Германия) се извършва с прясно замразени чернодробни тъкани (-196 ° C, течен азот) в продължение на 3 минути при стайна температура. Плъзгачите, оцветени с H & E- и ORO, бяха визуализирани с помощта на светлинен микроскоп, за да се изследва архитектурата на чернодробните и чернодробните липидни капчици. Пробите от чернодробна тъкан от 3-5 плъхове от всяка група бяха подготвени, оцветени и впоследствие изображенията бяха заснети с помощта на цифров фотоапарат Olympus (BX40; Olympus Corporation, Япония) и софтуера NIS Element SF 4.00.06 (Nikon Corporation, Tokyo, Япония).

Уестърн блотинг на Sirt1, PGC-1α и ядрен фактор κ-усилвател на лека верига на активирани В клетки (NF-κB) p65

Количествена полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (RT-qPCR) за експресия на mRNA Sirt1, PGC-1α и NF-kB

Статистически анализ

Фигура 1.

Фигура 2.

Фигура 3.

Резултати от парафинова секция и оцветяване с хематоксилин и еозин in vivo (увеличение, × 100). Изображения на чернодробни тъкани от (A) хранени с чау, (B) диетичен модел с високо съдържание на мазнини, (C) GGQLD-ниска доза, (D) GGQLD-висока доза и (E) третирани с ресвератрол плъхове. GGQLD, отвара Gegen Qinlian.

Освен това бяха открити малко липидни капчици в чернодробните секции от групата на чау при анализ на оцветяване с ORO (фиг. 4А). В сравнение с този на моделни плъхове, хранени с HFD (фиг. 4В), GGQLD и Res1 значително ограничават отлагането на липидни капчици в хепатоцитите (фиг. 4C-E).

Фигура 4.

Резултати от замразени чернодробни секции, оцветени с масло червено O in vivo (увеличение, × 400). Червените петна показват липидни капчици в хепатоцитите. Изображения от (A) храна с чау, (B) модел на диета с високо съдържание на мазнини, (C) GGQLD-ниска доза, (D) GGQLD-висока доза и (E) третирани с ресвератрол плъхове. GGQLD, отвара Gegen Qinlian.

GGQLD регулира експресията на Sirt1, PGC-1α и NF-κB (p65) при плъхове с HFD-индуцирана NAFLD

Изследвана е възможността GGQLD да има регулаторен ефект върху експресията на Sirt1, PGC-1α и NF-κB (p65). Както е показано на фиг. 5, нивото на протеина Sirt1 е значително намалено в групата с HFD (P 0,05 спрямо групата с HFD).

Фигура 5.

Фигура 6.

Уестърн блотинг за PGC-1α в чернодробната тъкан. PGC-1α, активиран от пероксизомен пролифератор рецептор-y коактиватор-1α; HFD, диета с високо съдържание на мазнини; GGQLD-H, отвара Gegen Qinlian висока доза; GGQLD-L, отвара Gegen Qinlian ниска доза; Resl, ресвератрол.

Фигура 7.

Уестърн блотинг за NF-kB (p65) в чернодробната тъкан. NF-kB, ядрен фактор κ-усилвател на леката верига на активирани В клетки; HFD, диета с високо съдържание на мазнини; GGQLD-H, отвара Gegen Qinlian висока доза; GGQLD-L, отвара Gegen Qinlian ниска доза; Resl, ресвератрол.

Валидиране на GGQLD ефекти върху Sirt1, PGC-1α и NF-κB генна експресия с помощта на RT-qPCR

Фигура 8.

Фигура 9.

Фигура 10.

Обратна транскрипция-количествена полимеразна верижна реакция за експресия на NF-κB в чернодробната тъкан. ▲ P + -зависими ензими, които се активират лесно от Resl (34). Доказано е, че Sirt1 повишава геномната стабилност и устойчивостта на клетъчен стрес и регулира енергийния метаболизъм и клетъчното стареене чрез деацетилиране на целеви протеини, включително p53, транскрипционни фактори на виличната кутия и PGC-1α (35–38). Той поддържа окислението на мастните киселини при ниски концентрации на глюкоза и е регулатор на PGC-1α, който активира PPARγ и индуцира транскрипцията на метаболитно значими гени за окисляване на митохондриалната мастна киселина (8). През последните години многобройни проучвания (39,40) стигат до заключението, че активирането на Sirt1 има отрицателен регулаторен ефект върху възпалителните процеси. Един от ключовите протеини в тези процеси е NF-κB, който критично модулира ДНК транскрипцията при възпалителни, инфекциозни и апоптотични процеси (41). Дисрегулацията на NF-кВ може да доведе до възпалителни и автоимунни заболявания. Все повече доказателства разкриват, че активирането на NF-κB допринася за патогенезата на NAFLD/NASH и развитието на хепатоцелуларен карцином (23). Активирането на Sirt1 деацетилира субединицата RelA/p65 и по този начин инхибира NF-κB сигнализирането (42,43).

Животински модел на HFD-индуцирана NAFLD е широко използван за идентифициране на патогенезата и оценка на нови лечения за NAFLD (44,45). В настоящото проучване 8 седмици на HFD-индуцирана мастна чернодробна болест при плъхове Sprague-Dawley, при която ключови биохимични характеристики и хистологични аномалии бяха разкрити чрез H & E- и ORO оцветени чернодробни проби, бяха в съответствие със съществуващите доклади (44,46 ). Въпреки че проучванията (47) са фокусирани върху терапиите за NAFLD, не са одобрени фармакологични агенти за лечението му. Следователно по-голямата част от клиничните усилия в момента са насочили фокуса си към стратегии, свързани с метаболитни синдроми, а именно затлъстяване, диабет, дислипидемия и хипертония (48). Други интервенции са насочени към специфични пътища, които потенциално участват в патогенезата на NAFLD, включително оксидативен стрес, инсулинова резистентност и провъзпалителни цитокини (49).

Многобройни проучвания са използвали адипоцити, за да докажат, че Resl има потенциал против затлъстяване, като намалява пролиферацията на адипоцити, индуцира апоптоза на адипоцитите, инхибира диференциацията на преадипоцитите, намалява липогенезата и насърчава липолизата и β-окислението на мастните киселини (50–54). Тези ефекти могат да бъдат медиирани от централните регулатори на адипогенезата, липогенезата и β-окисляването на мастните киселини, включително гореспоменатите AMPK, Sirt1 и PGC-1α (55). Resl, деацетилаза, е индиректен активатор на Sirt1, който увеличава вътреклетъчната циклична AMP (cAMP) концентрация чрез инхибиране на cAMP фосфодиестерази, които понижават регулирането на cAMP (56). Освен това, повишените концентрации на сАМР активират AMPK, който накрая се свързва с промотора на PGC-1α, демонстрирайки важната си ензимна роля в регулирането на хомеостазата на клетъчната енергия (57).

Доказано е, че CHM проявява изключително благоприятен ефект върху множество заболявания (58–60), а използваните формулировки имат относително широка безопасност. Нашето предишно проучване (14) демонстрира, че GGQLD терапевтично управлява NAFLD чрез подобряване на PPARγ дисрегулацията, като по този начин регулира липидите и потиска възпалението. В настоящото проучване лечението с GGQLD в продължение на 8 седмици значително понижава чернодробните чернодробни аминотрансферази (ALT и AST) до ниво, което е сравнимо с това на нормалната контролна група, хранена с чау. Освен това той е ефективен при възпрепятстване на мастната инфилтрация, което се доказва от намалените чернодробни TC, LDL и липидни капчици. Въпреки че патогенните механизми на NAFLD все още се разследват, натрупването на мазнини, особено TG филтрацията в хепатоцитите, се счита за първата стъпка в развитието на NAFLD (1). Следователно, натрупването на липиди играе потвърдена жизненоважна роля при NAFLD. Резултатите от биохимичните и хистологичните анализи показват, че GGQLD-L и Resl намаляват серумните LDL-C и TC съответно. Освен това нивата на HDL-C бяха повишени в групата GGQLD-H, докато хистологичното оцветяване разкри, че GGQLD-L, GGQLD-H и Resl намаляват липидните капчици в хепатоцитите и нормализират стеатозата при HFD плъхове.

Sirt1, регулатор на PGC-1α, който активира PPARy, индуцира транскрипцията на метаболитно значими гени за окисление на митохондриалните мастни киселини (8). Тази каскада има отрицателен регулаторен ефект върху възпалителните процеси. Настоящото проучване демонстрира, че GGQLD и Resl очевидно подобряват нивото на експресия на протеини Sirt1 и ген. Въпреки че GGQLD и Resl значително и значително намаляват NF-κB генната експресия, протеиновата експресия демонстрира тенденция на спад. Експресията на PGC-1α ген и протеин в HFD групата е леко намалена в сравнение с тази в групата на чау, но не значително. Въпреки това, очевидно увеличение на експресията на гена PGC-1α се наблюдава в групата GGQLD-H в сравнение с групите на чау и HFD. Забележително е, че GGQLD повишава протеина Sirt1 и генната експресия, с ефекти, които са сравними с тези на Resl.

По този начин, въз основа на данните от настоящото проучване, GGQLD оказа положителен ефект върху NAFLD чрез подобряване на регулацията на Sirt1, който има критична роля в регулирането на липидите и възпалението, като по този начин бяха предоставени допълнителни експериментални доказателства в подкрепа на клиничната му употреба. Тъй като растителното съдържание на GGQLD се използва от хилядолетия в традиционната медицина, то се счита за относително безопасно, надеждно и поносимо. В обобщение, настоящото проучване изследва GGQLD като потенциален незадължителен подход за лечение на NAFLD чрез управление на липидния метаболизъм, възпаление и хистологични аномалии по пътя Sirt1. По-нататъшните експерименти ще се съсредоточат върху чревния имунен отговор при NAFLD, базиран на участието на оста на черния дроб, като се използват системни биологични и омически методи.

Благодарности

Настоящото проучване беше подкрепено от Младежкия фонд на Националната фондация за естествени науки на Китай (грант № 81503407) и Самоизбраният предмет на Пекинския университет по грантове на китайската медицина (грант № 2015-JYB-JSMS125 и 2013-JYBZZ- XS-153).

Препратки

Dowman JK, Tomlinson JW и Newsome PN: Патогенеза на безалкохолна мастна чернодробна болест. QJM. 103: 71–83. 2010. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

• Средиземноморска диета и безалкохолна мастна чернодробна болест
• Безалкохолна мастна чернодробна болест (NAFLD) за предотвратяване ролята на средиземноморската диета и физическия
• Повече протеини в диетата могат да намалят мастната чернодробна болест и да намалят риска от диабет dLife
• Средиземноморската диета помага при безалкохолни мастни чернодробни заболявания Maximum Wellness
• NASH диетичен обратен неалкохолен стеатохепатит; Затлъстяване на черния дроб