Лаборатория по имунология, Национални институти по алергия и инфекциозни болести, Национални здравни институти, Bethesda, MD, САЩ

Катедра по патология, Медицинско училище Кек, Университет на Южна Калифорния, Лос Анджелис, Калифорния, САЩ

Лаборатория по имунология, Национални институти по алергия и инфекциозни болести, Национални здравни институти, Bethesda, MD, САЩ

Пълна кореспонденция: Д-р Итън М. Шевач, Лаборатория по имунология, NIAID/NIH Blg. 10 RM11N315, Bethesda, MD 20892, САЩ

Допълнителна кореспонденция: Д-р Джефри Л. Стивънс, Medimmune, Gaithersburg, MD, САЩ

Лаборатория по имунология, Национални институти по алергия и инфекциозни болести, Национални здравни институти, Bethesda, MD, САЩ

Лаборатория по имунология, Национални институти по алергия и инфекциозни болести, Национални здравни институти, Bethesda, MD, САЩ

Лаборатория по имунология, Национални институти по алергия и инфекциозни болести, Национални здравни институти, Bethesda, MD, САЩ

Пълна кореспонденция: Д-р Итън М. Шевач, Лаборатория по имунология, NIAID/NIH Blg. 10 RM11N315, Bethesda, MD 20892, САЩ

Допълнителна кореспонденция: Д-р Джефри Л. Стивънс, Medimmune, Gaithersburg, MD, САЩ

Лаборатория по имунология, Национални институти по алергия и инфекциозни болести, Национални здравни институти, Bethesda, MD, САЩ

Катедра по патология, Медицинско училище Кек, Университет на Южна Калифорния, Лос Анджелис, Калифорния, САЩ

Лаборатория по имунология, Национални институти по алергия и инфекциозни болести, Национални здравни институти, Bethesda, MD, САЩ

Пълна кореспонденция: Д-р Итън М. Шевач, Лаборатория по имунология, NIAID/NIH Blg. 10 RM11N315, Bethesda, MD 20892, САЩ

Допълнителна кореспонденция: Д-р Джефри Л. Стивънс, Medimmune, Gaithersburg, MD, САЩ

Лаборатория по имунология, Национални институти по алергия и инфекциозни болести, Национални здравни институти, Bethesda, MD, САЩ

Лаборатория по имунология, Национални институти по алергия и инфекциозни болести, Национални здравни институти, Bethesda, MD, САЩ

Лаборатория по имунология, Национални институти по алергия и инфекциозни болести, Национални здравни институти, Bethesda, MD, САЩ

Пълна кореспонденция: Д-р Итън М. Шевач, Лаборатория по имунология, NIAID/NIH Blg. 10 RM11N315, Bethesda, MD 20892, САЩ

Допълнителна кореспонденция: Д-р Джефри Л. Стивънс, Medimmune, Gaithersburg, MD, САЩ

Резюме

Въведение

В настоящото изследване използвахме неразрушаващ, рекомбинантен Fc-GITR-L и комбинации от GITR WT и GITR KO Treg клетки и Teff клетки, за да преразгледаме ефектите на GITR стимулация върху всяка субпопулация както при неманипулирани мишки, така и при добре характеризирани модел на възпалително заболяване на червата (IBD). Ние демонстрираме, че ефектите от тази Fc-GITR-L-индуцирана GITR сигнализация са сложни и зависят от физиологичната среда в гостоприемника, както и от състоянието на активиране на Treg клетките и Teff клетките. Обсъждат се последиците от тези резултати по отношение на терапевтичната манипулация на имунния отговор от членове на TNFRSF.

Резултати

Ангажирането на GITR стимулира разширяването както на Foxp3 +, така и на Foxp3 - Т клетки при наивни мишки

модулация

Fc ‑ GITR ‐ L изостря IBD, като засилва разширяването на патогенните Т клетки

GITR също се експресира върху APCs и NK клетки при ниски нива 2 и се предполага 22, 23, че някои от ефектите от ангажирането на GITR in vivo могат да бъдат вторични спрямо модулацията на вродените имунни функции. За да се справим с този проблем, прехвърлихме CD4 + CD45RB hi T клетки от GITR -/- мишки на RAG -/- мишки (подкрепяща информация, фиг. 2А). CD4 + CD45RB hi T клетки от GITR -/- мишки са също толкова ефективни при предизвикване на загуба на тегло, колкото CD4 + CD45RB hi T клетки от WT мишки (фиг. 2А в сравнение с подкрепяща информация, фиг. 2А). Въпреки това, лечението с Fc-GITR-L не влошава загубата на тегло или увеличава абсолютния брой CD4 + Т клетки, секретиращи IFN-γ в мезентериалната LN (подкрепяща информация, фиг. 2В). Това проучване показва, че ефектите от приложението на GITR-L се медиират директно върху Teff клетки, а не индиректно върху клетките на вродената имунна система.

Ангажирането на GITR индуцира загуба на Treg-клетки в модела на IBD

Тъй като лечението с Fc-GITR-L е способно предимно да разширява клетките Treg при нормални неманипулирани мишки и може също така да увеличи броя на клетките Teff при липса на клетки Treg, беше от интерес да се определи кой от тези ефекти преобладава в модела на IBD. Прехвърлихме CD4 + CD45RB hi GFP - Т клетки (4 × 10 5) от Foxp3 ‐ GFP чук при мишки заедно с CD4 + GFP + Treg клетки (2 × 10 5) в RAG KO мишки. Мишките, третирани с Fc-GITR-L, показват загуба на тегло, докато нетретираните мишки бяха, както се очакваше, защитени от IBD (фиг. 3А). Изненадващо, както процентите, така и абсолютният брой Foxp3 + Т клетки в мишки, третирани с Fc-GITR-L, бяха намалени в мезентериалната LN, но тази разлика не беше статистически значима (Фиг. 3В). Ние не разчитахме на GFP експресия за откриване на Foxp3 + Т клетки и във всички проучвания извършихме вътреклетъчно оцветяване за експресия на Foxp3.

Fc-GITR-L стимулацията намалява експресията на Foxp3 при лимфопенични условия

Една от възможностите е, че Foxp3 + Т клетките, които са загубили експресията на Foxp3 и могат да бъдат наречени ex-Treg клетки 24, са превърнати в патогенни Teff клетки. Нито един от RAG -/- реципиентите на Treg клетки не е загубил тегло по време на 8-седмичното лечение с Fc-GITR-L (фиг. 5D). Честотата на CD4 + Т клетки, продуциращи IFN-γ, е сходна в популациите ex-Treg-клетки в третирани и нелекувани групи (Фиг. 5Е). Значително увеличение на IL-17, продуциращи ex-Treg клетки, се наблюдава при mLN на мишки, третирани с GITR-L (Фиг. 5F). Останалите Foxp3 + Т клетки съдържат много ниско (

Дискусия

Няма съмнение, че модулацията на броя и/или функцията на клетките Foxp3 + Treg представлява основна цел за терапията на автоимунни заболявания. Членовете на TNFRSF играят разнообразна роля за фина настройка на имунните отговори и няколко членове са преференциално изразени в клетки Foxp3 + Treg, включително GITR (TNFRSF18), OX40 (TNFRSF4) 25 и DR3 (TNFRSF25) 26. Един основен проблем, който остава неразрешен, е дали терапевтичното насочване на членовете на TNFRSF може да се използва за подобряване на функцията на Treg-клетки in vivo и дали този подход може да се използва като алтернатива на лечение с IL-2 27 или Treg-клетъчна клетъчна биотерапия 28. Въпреки че някои проучвания демонстрират селективен ефект на агонистични mAbs или разтворими лиганди върху тези рецептори върху Treg-клетъчната функция 13 на мишката, интерпретацията на повечето от тези проучвания е сложна, тъй като тези реагенти също оказват мощни костимулиращи ефекти върху Teff клетките и някои от реагентите могат да доведат до изчерпване на Treg-клетки 16. Някои от последните проучвания вероятно са били интерпретирани погрешно като демонстриращи обръщане на Treg-клетъчната супресорна функция, вторично вследствие на ангажирането на GITR върху Treg клетки.

По принцип лечението с GITR-L увеличава броя на IFN-γ-продуциращите клетки, но не оказва влияние върху броя на IL-17-продуциращите клетки. Ролята на IL-17 в патогенезата на IBD остава противоречива 29. В някои проучвания наблюдаваме увеличаване на IL-17-продуциращите клетки при условия, при които клетките Treg са имали терапевтичен ефект. Възможно е тези клетки да представляват защитни Th17 клетки 30. Когато WT Treg клетките бяха прехвърлени на RAG KO мишки в отсъствието на Teff клетки, Fc-GITR-L третирането доведе до почти пълна загуба на експресия на Foxp3, но ex-Treg клетките продължиха и не предизвикаха заболяване през 8-те седмици на ученето. Вероятно неспазването на болестта през този период от време е било вторично по отношение на устойчивостта на някои Treg клетки, които поддържат експресията на Foxp3. Подобно отсъствие на индукция на заболяването се наблюдава в друго проучване, при което Foxp3 + Т клетки са прехвърлени на получатели на RAG -/- 31. Докато 50% от клетките губят експресията на Foxp3, реципиентите не развиват IBD. Когато обаче Foxp3 - клетките бяха изолирани и прехвърлени на вторични RAG -/- мишки, реципиентите развиха възпаление на тъканите.

Взети заедно, GITR активирането на Treg клетки може да има различни резултати в зависимост от експерименталния контекст, вариращ от експанзия при нормални мишки до смърт в модела на IBD. Това двойно действие на ангажирането на GITR върху клетки Treg не е неочаквано, тъй като подобно на други членове на TNFRSF, GITR може да активира повече от един сигнален път. Активирането на NF-кВ пътя може да доведе до Treg-клетъчно разширяване 32, докато GITR сигнализирането чрез Siva може да доведе до апоптоза 33. Също така остава възможно бързото индуциране на Treg-клетъчна пролиферация в силно възпалителна среда да доведе до индуцирана от активиране клетъчна смърт чрез FAS/FAS-L или TNF/TNFR. Взети заедно, преводът на изследванията на GITR функцията в модела на мишката върху използването на Fc-GITR-L или агонистични mAbs при човек трябва да се извършва с повишено внимание в зависимост от изследваното заболяване (автоимунитет срещу туморен имунитет) и имунния статус на домакинът.

Материали и методи

Животни

C57BL/6 мишки са получени от Националния институт по рака (Frederick, MD). Foxp3-GFP мишки са получени от д-р V.J. Kuchroo (Харвардски университет, Бостън, Масачузетс) и се поддържа от Taconic Farms (Germantown, NY) по договор от NIAID. RAG -/- мишки, получени от Taconic Farms. GITR +/ - ембриони (Sv129 × B6) са предоставени от C. Ricarrdi (Медицинско училище в Университета в Перуджа, Перуджа, Италия). Преиздадено GITR +/ - мишките бяха кръстосани веднъж с мишки C57BL/6 и полученото потомство беше скринирано за мутантния алел чрез PCR. Идентифицираните GITR +/ - след това потомството се пресича, за да се генерира GITR -/- мишки. Всички мишки бяха отгледани и настанени в Националните здравни институти/Националния институт по алергии и инфекциозни болести при специфични условия, свободни от патогени. Всички проучвания са одобрени от Комитета за грижи и употреба на животните към NIAID.

Среда, mAbs и реактиви

Fc-GITR-L, конструкция № 178-14, беше изготвен, както беше описано по-рано 15. Анти-CD4 V-500 и PE-Cy5, анти-CD25 PE, анти-GITR-PE, анти-CD44 Alexa Fluor 700, CD45.2 алофикоцианин-eFluor 780, анти-CD45.1 PE-Cy7, фиксируема жизнеспособност багрило алофикоцианин ‐EFluor 780 и eFluor 450, анти-Foxp3 PE, eFlour 450 и алофикоцианин, ant-IL-17 Alexa Fluor 647 и anti-IFN-γ PE-Cy7 са закупени от (eBioscience, Сан Диего, Калифорния). PE-anti-CD25 (PC61), anti-GITR PE-Cy7, anti-CD45RB FITC и PE, anti-Ki67 PE и anti-BrdU FITC са закупени от BD Biosciences (Сан Хосе, Калифорния). Вътреклетъчното оцветяване се извършва с буферния комплект за оцветяване Foxp3, съгласно протокола на производителя (eBioscience или BD Biosciences). CD4 микрозърната са закупени от Miltenyi Biotec (Auburn, CA). Анализът на поточната цитометрия се извършва с помощта на софтуера FlowJo.

Пречистване на Т-клетъчни подмножества

Периферни LN и далаци са събрани от 8-седмични женски мишки. CD4 + Т клетки, обогатени от Automacs с помощта на CD4 микрозърна, обозначени с анти-CD4 PE-Cy5, анти-CD25 PE и CD45RB FITC или анти-CD4 PE-Cy5 и анти-CD45RB PE и пречистени чрез сортиране на клетки. Чистотата на CD4 + CD25 - CD45RB hi, CD4 + CD25 +, CD4 + GFP - CD45RB hi, CD4 + GFP + клетки е> 98%.

Разтваряне на Т-клетки и лечение с Fc-GITR-L

RAG KO мишки се инжектират i.v. със сортирани CD4 + Т-клетъчни субпопулации в PBS. Мишките са получили 5 × 10 5 CD4 + CD45RB високо от WT GITR или GITR KO мишки самостоятелно или в комбинация с 2 × 10 5 CD4 + GFP + GITR WT, CD4 + CD25 + GITR WT или CD4 + CD25 + GITR KO клетки; една група мишки са получили 2 × 105 CD4 + GFP + GITR WT само. Fc-GITR-L (200 μg) се инжектира i.v. един ден след разтваряне на Т-клетките и след това веднъж седмично, докато проучването не бъде прекратено. Мишките се претеглят седмично.

Тест за потискане

CD4 + CD25 - Т клетки и CD4 + CD25 + Т клетки се пречистват чрез клетъчно сортиране; чистотата след сортиране е> 98%. Тестовете за потискане се извършват, както е описано по-горе 3 .

Статистически анализ

Статистическите проучвания са сравнени с помощта на Mann-Whitney U тест и разликите се считат за статистически значими с стр

Благодарности

Тези проучвания са подкрепени със средства от Интрамуралната програма на Националния институт по алергии и инфекциозни болести.

Конфликт на интереси

Авторите не декларират никакъв финансов или търговски конфликт на интереси.

Като услуга за нашите автори и читатели, това списание предоставя подкрепяща информация, предоставена от авторите. Такива материали се рецензират и могат да бъдат преорганизирани за онлайн доставка, но не се редактират или копират. Въпросите за техническа поддръжка, произтичащи от поддържаща информация (различна от липсващите файлове), трябва да бъдат адресирани до авторите.