Експериментално
и терапевтични
Лекарство

• Последните две години
• Обща сума

• Миналата година 0
• Обща сума

• Миналият месец
• Изминалата година
• Обща сума

• Син-Банг Мао
• Ян-Хуа Ченг
• Ян-Инг Сю

Тази статия се споменава в:

Резюме

Анти-miR-204-5p [аденовирус AAV-U6-rno-miR-204-5p-CAG-подобрен зелен флуоресцентен протеин (EGFP); котка не. MICA2014002038], miR-204-5p имитира (аденовирус AAV-U6-mimic-rno-miR-204-5p-CAG-EGFP, 5′-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU-3 ′) и miRNA за отрицателен контрол (neg-miR, аденовирус AAV-U6 -imimic-rno-negative-miR-CAG-EGFP, 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ′) са получени от Shanghai GeneChem Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Диабетичните плъхове бяха разделени на случаен принцип в три групи: Neg-miR, anti-miR-204-5p и имитиращи групи. Плъховете с диабет в групата anti-miR-204-5p (n = 15) се инжектират с анти-miR-204-5p аденовирус (4.1 × 10 12 вирусен геном/ml) през каудалната вена. Диабетични плъхове в имитиращата група (n = 15) са получили miR-204-5p имитиращ аденовирус (4.1 × 10 12 вирусен геном/ml). Групата neg-miR (n = 15) се инжектира със същото количество neg-miR аденовирус. На 8 седмици ретиналните тъкани бяха извлечени за по-нататъшно изследване, както е описано по-долу.

Култура на ретинални епителни клетки на плъхове (rRECs)

Пет диабетични плъхове бяха анестезирани чрез интраперитонеално инжектиране на пентобарбитал натрий (30 mg/kg). Под анестезия очната ябълка на диабетични плъхове се изолира от диабетични плъхове и следващите плъхове се умъртвяват, използвайки смъртоносна доза пентобарбитал (100 mg/kg телесно тегло). Ретината се отделя от очната ябълка и се измива с балансиран солев разтвор на Hanks (H1020; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Пекин, Китай) и се смила на малки парчета (1 × 1 mm) с хирургически ножици. След филтриране през 30 µm найлоново сито, ретината се усвоява с 2.5% трипсин в продължение на 30 минути при 37 ° С. След центрофугиране (1500 × g в продължение на 5 минути) при стайна температура, rRECs бяха изолирани и култивирани в модифицираната от Dulbecco среда на Eagle (DMEM; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), съдържаща 20% фетален говежди серум (FBS); Sigma-Aldrich; Merck KGaA) при 37 ° C с 5% CO 2. Средният се подменяше на всеки три дни. rRECs бяха идентифицирани за ендотелна хомогенност чрез тестване за имунореактивност към антиген на фактор VII. rRECs бяха фиксирани с 4% параформалдехид, блокирани с 2% BSA за 1 h при стайна температура и инкубирани с миши анти-фактор VII антитяло (кат. № ab97614; Abcam, Кеймбридж, Великобритания) при 4 ° С за една нощ. Клетките се промиват и инкубират с конюгирани с Alexa Fluor® 647 магарешки анти-заешки имуноглобулин G вторични антитела (кат. № ab150075; Abcam) при 37 ° С за 2 часа. След това ядрената маса се оцветява с DAPI (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) в продължение на 10 минути при стайна температура. Сигналите бяха открити с флуоресцентен инвертиран микроскоп при увеличение × 200. Третият пасаж беше подготвен за последващи експерименти.

rRECs бяха засяти в 6-ямкови плаки при 1 х 106 клетки/ямка и култивирани в DMEM, допълнена с 10% FBS. При 70–80% плътност, клетките бяха трансфектирани с 100 nM miR-204-5p имитиращ (имитиращата група), miR-204-5p инхибитор (анти-miR-204-5p групата) или neg-miR (neg- miR група) с Lipofectamine 3000 (Roche Diagnostics, Базел, Швейцария). Ефективността на трансфекцията се определя чрез RT-qPCR. На 48 часа клетки се събират за последващи експерименти.

Трансмисионна електронна микроскопия

rREC при плътност 1 × 105 клетки/ямка се фиксират с 2,5% глутаралдехид в 0,1 М фосфатен буфер рН 7,4 в продължение на 2 часа при стайна температура. След промиване с 0,1 М фосфатен буфер, пробите се оцветяват с 1% осмиев тетроксид за 1 h при стайна температура. След дехидратация с етанолов градиент, пробите се влагат в смола LX-112 и се нагряват при 70 ° С за една нощ. Секциите бяха нарязани на ултратънки разрези (70 nm) и изобразени с FEI Tecnai Spirit електронен микроскоп за пропускане (FEI; Thermo Fisher Scientific, Inc.) при увеличения × 1700 и × 5000

RT-qPCR анализ

Уестърн блотинг

Протеините бяха изолирани от ретиналните тъкани и rRECs, използвайки радиоимунопреципитационен буфер за анализ (Sigma-Aldrich; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Концентрацията на протеини се определя чрез комплект бицинхонинова киселина (Beyotime Institute of Biotechnology, Шанхай, Китай) съгласно протокола на производителя. Равни количества протеин (60 ug) се разделят с помощта на SDS-PAGE върху 12% гелове и се прехвърлят в мембрани от поливинилиден дифлуорид (Millipore; Merck KGaA). След блокиране с 5% обезмаслено мляко за 1 h при стайна температура, мембраните се сондират със заешко анти-LC3B антитяло (кат. № ab51520; 1: 3 000; Abcam) или анти-β-актин (кат. № ab8226; 1: 1000; Abcam) през нощта при 4 ° C. След това мембраните се измиват с TBS плюс Tween-20 (0,1%) и се инкубират с конюгирани с хрян пероксидаза кози анти-заешки вторични антитела (кат. № sc-516078; 1: 1000; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, Тексас, САЩ) за 2 часа при 37 ° С. Целевите ленти са разработени с подобрен комплект за откриване на хемилуминесценция (Amersham; GE Healthcare, Чикаго, IL, САЩ). Лентовите плътности бяха изчислени с помощта на софтуера Quantity One версия 4.5.1 (Bio-Rad Laboratories, Inc.) и нормализирани до β-актин.

Имунохистохимия

Ретиналните тъкани бяха изолирани от различните групи на 8 седмици след инжектиране на STZ, фиксирани с 10% прясно приготвен ледено студен параформалдехид при 4 ° С за една нощ и нарязани на 5-µm участъци. Секциите бяха инкубирани с 5% говежди серумен албумин (BSA; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) при 37 ° С за 1 h, за да се блокират неспецифичните места. След това срезовете бяха инкубирани с заешко поликлонално анти-LC3B антитяло (1: 1,000) в продължение на 2 часа при стайна температура. След измиване с PBS (3 ×), предметните стъкла се сондират с конюгирани с пероксидаза от хрян кози анти-заешки антитела за 2 h при стайна температура. Свързването на имунопероксидазата се визуализира чрез реакция с разтвор на диаминобензидин-Н202. Пет непокриващи се полета бяха случайно уловени от обърнат микроскоп при увеличение × 400. LC3B-положителните клетки се оцветяват в кафяво или тъмно жълто.

Статистически анализ

Фигура 1.

Фигура 2.

Фигура 3.

Фигура 4.

miR-204-5p понижава експресията на LC3B-II и съотношението на LC3B-II/LC3B-I in vitro. rRECs бяха изолирани от диабетични плъхове и трансфектирани с anti-miR, имитиращ мравка neg-miR. (А) Чистотата на rRECs се определя чрез оцветяване с фактор VII; фактор VII-положителни клетки са представени в червено и ядра в синьо. Мащабна лента, 100 µm. (Б) Количеството на автофагичните вакуоли се определя чрез пропускаща електронна микроскопия (увеличение, × 1700 и × 5000). Скала в бяло, 2 µm; скала в червено, 1 µm. (C) Нива на експресия на miR-204-5p в трансфектирани клетки. (D) Western blot изображения и количествен анализ на експресията на LC3B-II протеин и (E) съотношението LC3B-II/LC3B-I. (F) нива на експресия на иРНК на VEGF. Относителната експресия на miR-204-5p се нормализира до U6 и VEGF се нормализира до β-актин. ** Р 1

Santos LL, Lima FJC, Sousa-Rodrigues CF и Barbosa FT: Използване на SGLT-2 инхибитори при лечението на захарен диабет тип 2. Rev Assoc Med Bras (1992). 63: 636–641. 2017. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Murchison AP, Hark L, Pizzi LT, Dai Y, Mayro EL, Storey PP, Leiby BE и Haller JA: Неспазване на грижата за очите при хора с диабет. BMJ Open Diabetes Res Care. 5: e0003332017. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Leasher JL, Bourne RR, Flaxman SR, Jonas JB, Keeffe J, Naidoo N, Pesudovs K, Price H, White RA, Wong TY, et al: Erratum. Глобални оценки за броя на хората, слепи или с увредено зрение от диабетна ретинопатия: Мета-анализ от 1990–2010. Диабетна грижа 2016; 39: 1643-1649. Грижа за диабета. 39: 20962016. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Arroba AI, Campos-Caro A, Aguilar-Diosdado M и Valverde AM: IGF-1, възпаление и дегенерация на ретината: тясна мрежа. Предно застаряващи невроски. 10: 2032018. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Hou L, Wei L, Zhu S, Wang J, Quan R, Li Z и Liu J: Птичият метапневмовирусен подгрупа C индуцира автофагия по пътя на ATF6 UPR. Автофагия. 13: 1709–1721. 2017. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Wang L, Feng D, Liu Y, Li S, Jiang L, Long Z и Wu Y: Автофагията играе защитна роля при дегенерация на двигателния неврон след исхемия на гръбначния мозък/индуцирана от реперфузия спастична парализа Am J Transl Res. 9: 4261–4270. 2017. PubMed/NCBI

Gao N, Wang H, Yin H и Yang Z: Ангиотензин II индуцира медиирана от калций автофагия в подоцитите чрез повишаване на нивата на реактивни кислородни видове. Chem Biol Interact. 277: 110–118. 2017. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Wang T, Zhang L, Hu J, Duan Y, Zhang M, Lin J, Man W, Pan X, Jiang Z, Zhang G, et al: Mst1 участва в прогресията на атеросклерозата чрез инхибиране на автофагия на макрофагите и усилване на апоптозата на макрофагите. J Mol Cell Cardiol. 98: 108–116. 2016. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Dehdashtian E, Mehrzadi S, Yousefi B, Hosseinzadeh A, Reiter RJ, Safa M, Ghaznavi H и Naseripour M: Патогенеза на диабетната ретинопатия и подобряващите ефекти на мелатонина; участие на автофагия, възпаление и оксидативен стрес. Life Sci. 193: 20–33. 2018. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Lopes de Faria JM, Duarte DA, Montemurro C, Papadimitriou A, Consonni SR и Lopes de Faria JB: Дефектна автофагия при диабетна ретинопатия. Инвестирайте Ophthalmol Vis Sci. 57: 4356–4366. 2016. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, Yamamoto A, Kirisako T, Noda T, Kominami E, Ohsumi Y и Yoshimori T: LC3, хомолог на бозайник от дрожди Apg8p, се локализира в автофагозомни мембрани след обработка. EMBO J. 19: 5720–5728. 2000. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Alizadeh S, Mazloom H, Sadeghi A, Emamgholipour S, Golestani A, Noorbakhsh F, Khoshniatnikoo M и Meshkani R: Доказателство за връзката между дефектната автофагия и възпалението в мононуклеарни клетки от периферна кръв на пациенти с диабет тип 2. J Physiol Biochem. 74: 369–379. 2018. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Chandra S, Vimal D, Sharma D, Rai V, Gupta SC и Chowdhuri DK: Роля на miRNAs в развитието и заболяванията: Уроци, научени от малки организми. Life Sci. 185: 8–14. 2017. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Nadeem A, Ashraf MR, Javed M, Hussain T, Tariq MS и Babar ME: Review-microRNAs: Нова парадигма към механистично прозрение на болестите. Pak J Pharm Sci. 31: 2017–2026. 2018. PubMed/NCBI

Gong Q, Xie J, Liu Y, Li Y и Su G: Диференциално изразени микронари в развитието на ранна диабетна ретинопатия. J Диабет Res. 2017: 47279422017. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Chen Q, Qiu F, Zhou K, Matlock HG, Takahashi Y, Rajala RVS, Yang Y, Moran E и Ma JX: Патогенна роля на microRNA-21 в диабетната ретинопатия чрез понижаване на регулацията на PPARα. Диабет. 66: 1671–1682. 2017. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Haque R, Iuvone PM, He L, Choi KSC, Ngo A, Gokhale S, Aseem M и Park D: Сигнализиращият път MicroRNA-21 е включен в индуцирана от проренин рецептор (PRR) експресия на VEGF в ARPE-19 клетки под хипергликемичен състояние. Мол Вис. 23: 251–262. 2017. PubMed/NCBI

Gomaa AR, Elsayed ET и Moftah RF: Експресия на MicroRNA-200b в стъкловидното тяло на пациенти с пролиферативна диабетна ретинопатия. Офталмологичен Res. 58: 168–175. 2017. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Wu JH, Gao Y, Ren AJ, Zhao SH, Zhong M, Peng YJ, Shen W, Jing M и Liu L: Променени профили на експресия на микроРНК в ретините с диабетна ретинопатия. Офталмологичен Res. 47: 195–201. 2012. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Gao J, Wang Y, Zhao X, Chen P и Xie L: Регулирането на SIRT1, медиирано от MicroRNA-204-5p, допринася за забавянето на преминаването на епителния клетъчен цикъл в диабетната роговица. Инвестирайте Ophthalmol Vis Sci. 56: 1493–1504. 2015. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Nathan DM, Buse JB, Davidson MB, Heine RJ, Holman RR, Sherwin R и Zinman B: Управление на хипергликемия при диабет тип 2: Консенсусен алгоритъм за започване и коригиране на терапията. Декларация за консенсус на Американската асоциация за диабет и Европейската асоциация за изследване на диабета. Diab Tologia. 49: 1711–1721. 2006. Преглед на статия: Google Scholar

Livak KJ и Schmittgen TD: Анализ на данните за относителна генна експресия, използвайки количествена PCR в реално време и метода 2 (−Delta Delta C (T)). Методи. 25: 402–408. 2001. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Rubsam A, Parikh S и Fort PE: Роля на възпалението при диабетна ретинопатия. Int J Mol Sci. 19 (pii): E9422018. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Kaneko H и Terasaki H: Биологично участие на MicroRNAs в пролиферативна витреоретинопатия. Transl Vis Sci Technol. 6: 52017. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Wu D, Pan H, Zhou Y, Zhang Z, Qu P, Zhou J и Wang W: Повишеното регулиране на microRNA-204 инхибира клетъчната пролиферация, миграция и инвазия в човешки бъбречно-клетъчни карциномни клетки чрез понижаване на регулирането на SOX4. Mol Med Rep. 12: 7059–7064. 2015. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Liu J и Li Y: Трихостатин А и тамоксифен инхибират растежа на клетките на рак на гърдата чрез miR-204 и ERalpha, намаляващи AKT/mTOR пътя. Biochem Biophys Res Commun. 467: 242–247. 2015. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Lorenzon L, Cippitelli C, Avantifiori R, Uccini S, French D, Torrisi MR, Ranieri D, Mercantini P, Canu V, Blandino G и Cavallini M: Регулираните надолу miRs конкретно корелират с некардиални стомашни ракови заболявания и класификационна система на Lauren. J Surg Oncol. 116: 184–194. 2017. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Palkina N, Komina A, Aksenenko M, Moshev A, Savchenko A и Ruksha T: miR-204-5p и miR-3065-5p оказват противотуморно въздействие върху меланомните клетки. Онкол Лет. 15: 8269–8280. 2018. PubMed/NCBI

Gao W, Wu Y, He X, Zhang C, Zhu M, Chen B, Liu Q, Qu X, Li W, Wen S и Wang B: MicroRNA-204-5p инхибира инвазията и метастазирането на плоскоклетъчен карцином на ларинкса чрез потискане на вилицата кутия С1. J Рак. 8: 2356–2368. 2017. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Li H, Wang J, Liu X и ​​Cheng Q: MicroRNA-204-5p потиска медиирания от IL6 възпалителен отговор и генерирането на хемокини в HK-2 бъбречни тубуларни епителни клетки чрез насочване към IL6R. Biochem Cell Biol. 2018. (Epub преди печат). Преглед на статия: Google Scholar

Mizushima N, Levine B, Cuervo AM и Klionsky DJ: Автофагията се бори с болестите чрез клетъчно саморазграждане. Природата. 451: 1069–1075. 2008. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Volpe CMO, Villar-Delfino PH, Dos Anjos PMF и Nogueira-Machado JA: Клетъчна смърт, реактивни кислородни видове (ROS) и диабетни усложнения. Клетъчна смърт Dis. 9: 1192018. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Levine B и Kroemer G: Автофагия в патогенезата на заболяването. Клетка. 132: 27–42. 2008. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Yoshii SR и Mizushima N: Мониторинг и измерване на автофагия. Int J Mol Sci. 18 (pii): E18652017. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Li XC, Hu QK, Chen L, Liu SY, Su S, Tao H, Zhang LN, Sun T и He LJ: HSPB8 насърчава сливането на автофагозома и лизозома по време на автофагия в диабетни неврони. Int J Med Sci. 14: 1335–1341. 2017. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Cai X, Li J, Wang M, She M, Tang Y, Li H и Hui H: Лечението с GLP-1 подобрява диабетната ретинопатия чрез облекчаване на автофагията чрез сигнален път GLP-1R-ERK1/2-HDAC6. Int J Med Sci. 14: 1203–1212. 2017. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Kobayashi S, Xu X, Chen K и Liang Q: Потискането на автофагията е защитно при високо увреждане на кардиомиоцитите, предизвикано от глюкоза. Автофагия. 8: 577–592. 2012. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Rodrigues M, Xin X, Jee K, Babapoor-Farrokhran S, Kashiwabuchi F, Ma T, Bhutto I, Hassan SJ, Daoud Y, Baranano D, et al. клетки за насърчаване на неоваскуларизацията на ретината при пролиферативна диабетна ретинопатия. Диабет. 62: 3863–3873. 2013. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Nishijima K, Ng YS, Zhong L, Bradley J, Schubert W, Jo N, Akita J, Samuelsson SJ, Robinson GS, Adamis AP и Shima DT: Съдов ендотелен растежен фактор-A е фактор за оцеляване на невроните на ретината и критичен невропротектор по време на адаптивния отговор на исхемична травма. Am J Pathol. 171: 53–67. 2007. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Gilbert RE, Vranes D, Berka JL, Kelly DJ, Cox A, Wu LL, Stacker SA и Cooper ME: Съдов ендотелен растежен фактор и неговите рецептори в контрола и диабетичните очи на плъхове. Лаборатория Инвест. 78: 1017–1027. 1998. PubMed/NCBI

Bai Y, Ma JX, Guo J, Wang J, Zhu M, Chen Y и Le YZ: Полученият от Muller клетки VEGF има значителен принос за неоваскуларизацията на ретината. J Pathol. 219: 446–454. 2009. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

Свързани статии

Април-2019
Том 17 Брой 4

Печат ISSN: 1792-0981
Онлайн ISSN: 1792-1015

• Хранителни вещества Безплатни пълнотекстови хранителни вещества за лечение на диабетна ретинопатия HTML
• Пренатални фактори, свързани с феталното висцерално затлъстяване - ScienceDirect
• Метаболитното здраве е по-тясно свързано с намаляване на белодробната функция, отколкото затлъстяването
• Наднорменото тегло и затлъстяването са свързани с намален риск от ревматоиден артрит при мъжете, но не и при
• Кожни промени и прояви, свързани с лечението на затлъстяване - ScienceDirect