Хироши Шимода

Шокецу Хитое

Сейку Накамура

2 Фармацевтичен университет в Киото, 1 Шичоно-чо, Мисасаги, Ямашина-ку, Киото 607-8412, Япония

Хисаши Мацуда

2 Фармацевтичен университет в Киото, 1 Шичоно-чо, Мисасаги, Ямашина-ку, Киото 607-8412, Япония

Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

Преобладаването на затлъстяването продължава да се увеличава и е основен здравен проблем в САЩ и в латиноамериканските страни (1, 2). В тези страни са използвани редица добавки за отслабване, съдържащи разнообразни съставки (3). Зеленият чай (листата на Camellia sinensis) и препаратите от зелен чай се продават и консумират като добавка за отслабване и управление на теглото от няколко години. Прегледите на клиничните доказателства обаче отчитат както положителни ефекти (4, 5), така и никакви ефекти (6, 7) върху загубата на тегло.

Механизмите на действие за потенциалната роля на зеления чай като съставка за отслабване включват комбинация от катехини и кофеин. Катехините усилват чернодробните метаболизиращи ензими, включително карнитин палмитоилтрансфераза (CPT) 1, за да стимулират окисляването на мазнините (8). Те също така инхибират активността на катехол-О-метилтрансферазата (COMT) и повишават норепинефрина и аденил циклазата. Следователно усвояването на глюкоза се намалява и липолизата се засилва. От друга страна, кофеинът стимулира симпатиковата нервна система, чувствителната към хормони липаза и регулирането на разединяващите протеини (UCP), което води до енергийни разходи и окисляване на мазнините (8). Oolong чай, дълбоко ферментирал зелен чай също е показал, че има ефекти срещу затлъстяването (9), тъй като in vitro проучванията показват, че полимеризираните катехинови производни инхибират чревната липазна активност и намаляват абсорбцията на мазнини от червата (10, 11).

Лилавият чай е разновидност на Camellia sinensis, разработена от Фондацията за изследване на чая в Кения (TRFK) и в момента се отглежда в Кения (12). Листата от лилав чай ​​се обработват по същия метод, използван за обработка на зеления чай. В допълнение към обичайните полифенолни съединения, открити в зеления чай, като епигалокатехин галат (EGCG) и епикатехин галат (ЕКГ), лилавият чай е уникален по това, че съдържа и антоцианидини (малвидин, пералгонодин и цианидин 3-О-галактозид) и 1, 2-ди-О-галоил-4,6-О- (S) -хексахидроксидифеноил-β-D-глюкоза (ПГ), хидролизуем танин (12). Лилавият чай също се различава от другите сортове Camellia sinensis по съдържанието на кофеин, което е относително по-ниско в сравнение със зеления и черния чай (13, 14). Следователно, HPLC хроматограмата на лилавия чай се различава от зеления чай и черния чай (фиг. (Фиг. 1). 1). Отчетените биологични активности на лилавия чай включват антитрипанозомна (15) и церебрална антиоксидантна активност (16). Ефектите срещу затлъстяването обаче все още не са оценени. Следователно ние подготвихме екстракт от лилав чай ​​(PTE) и оценихме ефекта върху натрупването на мазнини, предизвикано от диетата при мишки. Освен това са изследвани механизмът за борба със затлъстяването и активните съединения. Освен това е проведено малко клинично изпитване при леко затлъстели хора.

екстракт

HPLC хроматограма на 50% етанолов екстракт от чаени листа. Лилавият чай (А), японският зелен чай (В) и индийският черен чай (С) се екстрахират с 50% етанол при 40 ° С в продължение на 2 часа и разтворителите се изпаряват. HPLC хроматограмата се записва при 280 nm чрез UV детектор. HPLC състоянието е описано в материалите и методите. TB, теобромин; CA, кофеин; EGCG, епигалокатецин галат; ПГ, 1,2-ди-О-галоил-4,6-О- (S) -хексахидроксидифеноил-β-D-глюкоза; ЕКГ, епикатехин галат.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Подготовка на PTE и изолиране на съставките в PTE

За биологичен анализ, PTE е приготвен от изсушени листа на лилав чай ​​(Camellia sinensis, TRFK306), култивирани през 2012 г. в подножието на планината. Кения, включително районите Тика и Керугоя. Изсушените листа (1 kg) се екстрахират с 50% w/w воден етанол (10 L) за 2 h при 40 ° C. Разтворителят се изпарява до получаване на PTE (338 g). Основните съставки в PTE са теобромин (1,6%), кофеин (4,4%), EGCG (9,8%), парникови газове (7,4%) и ЕКГ (5,8%).

За да се изолират тези съставки, PTE (100 g) се разтваря в H2O (1 L) и се екстрахира с AcOEt (2 L) 3 пъти, за да се получи фракция AcOEt (35,7 g). След това H2O слой се екстрахира с n-BuOH (1.5 L), за да се получи BuOH фракция (32.4 g). Фракция BuOH (25 g) се разделя чрез ODS (375 g) колона от 30 до 100% MeOH. Фракцията (15 g), екстрахирана с 30% MeOH, се зарежда в колона Diaion ™ HP21 (150 g, Mitsubishi Chemical, Токио, Япония) и се промива с 10% MeOH. След това се зарежда 30% MeOH за получаване на 30% MeOH фракция (8.2 g). 30% MeOH фракция (4.3 g) се разделя чрез HPLC, оборудвана с ODS колона (Chromatorex ODS, Φ20 × 250 mm, Fuji Silysia Chemical Ltd., Kasugai, Япония), като се използва 30% MeOH за получаване на фракция 1 до 7. Индекс на пречупване ( За откриване е използван RI) детектор. Фракция 2 се пречиства чрез HPLC колона (Develosil TM ODS-SR-5, Φ20 × 250 mm, Nomura Chemical Co. Ltd., Seto, Япония), използвайки 40% MeOH за получаване на кофеин (117 mg). Фракции 3 и 4 се смесват и пречистват чрез HPLC колона (Develosil TM ODS-SR-5), като се използва 40% МеОН за получаване на теобромин (100 mg). Фракция 6 се пречиства чрез HPLC колона (Develosil TM ODS-SR-5), като се използва 40% МеОН за получаване на парникови газове (174 mg) и ЕКГ (45 mg). Изолирани съединения, включително ПГ (12), бяха идентифицирани чрез сравняване на 13 C- и 1H-NMR спектри и масспектри с отчетени стойности.

HPLC определяне на основните съставки в PTE

За оценка на сезонните промени на основните съставки в PTE са използвани листата, събрани от януари до септември 2013 г. в описаните по-рано райони. PTE, приготвен от листа, се анализира чрез HPLC, като се използват следните условия: TSKGEL ODS-80TS QA (Φ4,6 mm × 150 mm, Tosoh, Токио, Япония) и UV детектор 280 nm); дебитът беше фиксиран на 0.7 ml/min и 5% ацетонитрил, съдържащ 0.1% трифлуороцетна киселина (TFA) и ацетонитрил бяха използвани съответно за разтворители А и В. Температурата на колоната беше зададена на 35 ° С. Условията на градиент бяха 0 до 4 минути (разтворител А: 100%), 4 до 4,5 минути (разтворител А: 100 до 95%), 4,5 до 27 минути (разтворител А: 95 до 90%), 27 до 47 минути (разтворител А: 90 до 50%), 47 до 48 минути (разтворител А: 50 до 15%), 48 до 50 минути (разтворител А: 15%).

Животни и клетки

Експериментите са извършени в съответствие с Насоките за правилно провеждане на опити с животни (Специален съвет на Япония, 1 юни 2006 г.). Мъжки ICR мишки на възраст 5 и 10 седмици са закупени от Japan SLC Co. Ltd. (Хамамацу, Япония) и предварително аклиматизирани за една седмица в овлажнена стая (50 ± 5%) при 22 ± 2 ° C.

HepG2 хепатом са получени от JCRB клетъчна банка (Сенан, Япония).

Реактиви

Тест за триглицерид Е Wako, клофибрат, обезмаслено мляко, зехтин, модифицирана с Dulbecco среда Eagle (D-MEM) и фетален телешки серум (FCS) са закупени от Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Осака, Япония). Буфер за проби на Laemmli и мембрана от поливинилиден флуорид (PVDF) са получени от Bio-Rad Laboratories Inc. (Collage Station, AZ, USA). RIPA лизисно-екстракционен буфер, протеаза и фосфатазен инхибитор коктейл и Pierce Western Blotting Substrate Plus са закупени от Thermo Fischer Scientific Inc. (Waltham, MA, USA). Миши анти-CPT1A антитела са получени от Abcam (Кеймбридж, Великобритания). Конюгиран кози анти-миши IgG, свързан с пероксидаза от хрян (HRP), е закупен от Merck Millipore (Дармщат, Германия). Анти-β-актин моноклонално антитяло е получено от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, МО, САЩ). Орлистат (Xenical) е получен от F. Hoffmann-La Roche, Ltd. (Базел, Швейцария).

Високи мазнини, предизвикани от диетата, промени в телесното тегло и липидните параметри при мишки

Промени в серумния триглицерид при мишки, натоварени със зехтин

Експериментът следва метода, описан в предишния ни доклад (18). Мишките (на 6 седмици) бяха на гладно в продължение на 12 часа и кръвните проби бяха събрани от орбиталния синус под анестезия чрез стъклен капиляр. Тридесет минути по-късно PTE или неговите съставки се дават орално на мишките. След това зехтин (5 ml/kg) се зарежда перорално 1 час по-късно и кръвни проби се събират 2, 4 и 6 часа по-късно. Кръвните проби се центрофугират (3000 rppm, 5 минути), за да се получи серум. Съдържанието на триглицериди се измерва чрез триглицерид Е тест Wako.

CPT1A Протеинова експресия в HepG2 чернодробен хепатом

HepG2 клетки (4 × 104 клетки), суспендирани в 500 μL D-MEM, съдържащи 10% FCS, се посяват върху 24-гнездова културна плака и се инкубират при 37 ° С под 5% атмосфера на CO2 за един ден. Разтворът на PTE или неговите съставки се добавя към клетки и се култивира за още един ден. Клетките бяха събрани чрез 200 μL RIPA екстракционен и изолиращ буфер, съдържащ протеаза и фосфатазен инхибиторен коктейл. Експресията на CPT1A и β-актин се определя по предварително описана процедура.

Оценка на промените в параметрите на затлъстяването при хора чрез поглъщане на лилав чай

Експериментът е извършен в съответствие с 6-тата ревизия на Декларацията от Хелзинки от 2008 г. Като тестови субекти са избрани 10 мъже на възраст от 32 до 69 години (средна възраст: 47,1 години) с леко затлъстяване (ИТМ> 24). Включени критерии за изключване: дневен прием на лилав чай; алергични реакции; и сериозни нарушения като диабет, чернодробни заболявания, бъбречни заболявания или сърдечно-съдови заболявания. Преди започване на теста, на изпитваните субекти беше предоставено писмено одобрено от IRB обяснение и съгласие. Изчерпателното обяснение на теста беше последвано от сесия с въпроси и отговори и потвърждение, че те добре разбират подробностите на теста. След това изпитваните подадоха писмено съгласие за съгласието си.

На първия ден от тестовия период бяха взети кръвни проби от тестваните на гладно лица. ИЗМ, телесно тегло, телесна мастна маса, коремна мастна тъкан, мускулно количество, съотношение на телесните мазнини, мускулно съотношение, базален метаболизъм, влага, талия, ханш, съотношение талия: ханш, дебелина на подкожната мастна тъкан в корема, дебелина на подкожната мастна тъкан в горната част на ръката След измерването на всеки субект се дават изсушени лилави чаени листа (1,5 g/порция). Субектите поглъщат чая, извлечен от порцията лилав чай ​​с гореща вода (100-200 ml) два пъти дневно в продължение на 4 седмици. В последния ден от тестовия период отново бяха извършени измервания на параметрите на затлъстяването, за да се сравнят със стойностите преди поглъщане.

Статистически анализ

Данните са представени като средна стойност ± стандартна грешка (SE). За статистически сравнения в клетъчния експеримент беше извършен еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от теста на Dunnett. Сдвоеният t-тест е използван за изследвания върху хора. Стойност на p (фиг. 2). 2). Диапазонът на съдържанието на кофеин и теобромин е бил съответно 2,7 до 3,4% и 1,2 до 2,1%. Сред полифенолните съединения съдържанието на ЕКГ е относително стабилно и варира от 3,0 до 3,9%. Съдържанието на EGCG намаля от февруари до април и след това се увеличи през юни. Максималното съдържание на EGCG достигна 9,6% през септември. Съдържанието на парникови газове варира между 6,2 до 8,4%.

Сезонни промени на катехини, парникови газове и кофеин в PTE.

Ефекти на PTE върху натрупването на мазнини с високо съдържание на мазнини при мишки

Телесното тегло на контролната група надвишава това на нормалната група от 7 до 12 ден (фиг. (Фиг. 3). 3). PTE (200 mg/kg) потиска наддаването на телесно тегло от 6 до 12 ден в сравнение с контролната група. Крайното телесно тегло в групата с PTE е значително потиснато и средното телесно тегло е същото като нормалната група (Таблица (Таблица 1). 1). Теглото на черния дроб, епидидималната мастна тъкан и периреналната мазнина също бяха значително потиснати от PTE. Що се отнася до съдържанието на триглицериди, серумната TG и чернодробната TG също бяха потиснати от PTE.

Ефект на PTE върху експресията на протеин CPT1A при HFD на мишки, хранени. Всяка колона представлява средната стойност с S.E. (п = 6). Звездичките означават значителни разлики от контрола при **: p (Фиг. 5). 5). Орлистат (10 и 20 mg/kg), използван като положителен контрол, също значително потиска повишаването на TG. Сред съставните части на PTE полифенолните съединения, включително GHG, EGCG и ECG, не потискат повишаването на TG. Въпреки че теоброминът не потиска повишаването на TG, кофеинът (25 и 50 mg/kg) значително потиска повишаването в точката 2 часа след поглъщане на зехтин.

Ефект на PTE и неговите съставки върху повишаването на серумен TG при мишки, натоварени със зехтин. Всяка точка представлява средната стойност с S.E. (п = 6). Звездичките означават значителни разлики от контрола при * p ** p (Фиг.6). 6). Подобрението при 100 μg/ml беше значително (p * p Таблица 2, 2, след четириседмично поглъщане на лилав чай, ИТМ, телесно тегло, телесна мастна маса, коремна мастна тъкан, съотношение на телесните мазнини, размер на талията, размер на ханша и дебелината на мазнините в корема и дясната част на ръката са значително намалени в сравнение със стойностите преди поглъщане. Съотношението на мускулите значително се е увеличило след поглъщането на лилав чай. от преди поглъщане (Таблица (Таблица3 3).

Таблица 2

Сравнение на параметрите за затлъстяване преди и след поглъщането на лилав чай ​​от четири седмици

Преди поглъщане След поглъщане
ИТМ (kg/m 2)27,0 ± 0,626,8 ± 0,6 a
Телесно тегло (кг)80,8 ± 3,279,9 ± 3,1 a
Маса на телесните мазнини (кг)21,8 ± 1,521,0 ± 1,4 b
Коремна мастна тъкан (арбитражна единица)135,0 ± 8,5123,5 ± 8,5 b
Мускулно количество (%)24,9 ± 1,025,0 ± 1,0
Съотношение на телесните мазнини (%)26,8 ± 1,226,1 ± 1,2 a
Мускулно съотношение (%)30,9 ± 0,531,4 ± 0,5 b
Базален метаболизъм (kcal)1789 ± 731768 ± 70 a
Влага (%)43,2 ± 1,639,4 ± 4,3
Талия (см)97,6 ± 1,694,2 ± 1,7 b
Бедро (см)106,0 ± 1,5102,8 ± 1,6 a
Съотношение талия/ханш0,92 ± 0,010,92 ± 0,01
Дебелина на подкожната мастна тъкан в корема (mm)28,5 ± 1,424,4 ± 1,8 a
Дебелина на подкожната мазнина на дясната горна част на ръката (mm)28,5 ± 2,621,5 ± 1,6 b

Стойностите са посочени в средна стойност и стандартна грешка (n = 10). За оценка на значимостта е използван сдвоен t-тест. Значителните разлики са посочени като

Стойностите са посочени в средна стойност и стандартна грешка (n = 9). За оценка на значимостта беше използван сдвоен t-тест сред. Не се наблюдава значимост.

ДИСКУСИЯ

Що се отнася до чревната абсорбция на мазнини, кофеинът допринася за инхибиращия ефект на PTE. По-рано потвърдихме, че кофеинът допринася за инхибиращ ефект на екстракта от зелено кафе на зърна върху абсорбцията на мазнини (18), вероятно защото кофеинът е известен с това, че забавя изпразването на стомаха (26). Освен това, резултатите от предишни изследвания на Wang et al. показа, че кофеинът значително намалява скоростта на мезентериалния лимфен поток, което е пътят, по който се поемат абсорбираните мастни киселини по пътя към кръвния поток. EGCG няма ефект върху лимфния поток, което предполага, че ефектите на EGCG и кофеина върху абсорбцията на липиди се медиират чрез ясно различни механизми и варират в зависимост от типа липиди (27). Счита се, че ефектите на кофеина допринасят за намаляване на ефекта на PTE върху усвояването на мазнините.

В предишни клинични проучвания както кофеинът, така и катехините съобщават, че допринасят за потискащия ефект на зеления чай върху наддаването на телесно тегло (5). Ефектът срещу затлъстяването на катехините от зелен чай е лек и изисква по-висока доза (800 до 1200 mg/ден), когато са били използвани самостоятелно (28, 29). В действителност се съобщава, че EGCG (300 или 1500 mg/ден) няма ефект върху натрупването на мазнини при затлъстели лица (30, 31). Приблизително 400 mg/ден екстракт от зелен чай, съдържащ катехини и кофеин в комбинация, изглежда са необходими, за да проявят ефект срещу затлъстяването (32, 33). В нашето проучване, поглъщането на 3 g/ден лилави чаени листа в продължение на четири седмици подобрява параметрите на затлъстяването. Общото количество листа (3,0 g/ден) дава приблизително 600 mg PTE, добив на екстракция е 20%. Поради това е разумно в тази доза да се предполага, че основните съставки (кофеин и катехини) осигуряват ефектите срещу затлъстяването. В допълнение, парниковите газове, които се намират уникално в лилавите чаени листа с приблизително същата концентрация като EGCG, също могат да допринесат за ефекта срещу затлъстяването.

В заключение, резултатите ни показват, че листата на лилавия чай и неговият екстракт осигуряват ефекти срещу затлъстяването при мишки и хора и механизмите на действие изглежда използват три съединения. Кофеинът потиска усвояването на мазнини, докато комбинацията от кофеин и катехини води до засилен ефект против затлъстяване. И накрая, парниковите газове също могат да участват в метаболизиращия ефект на черния липид на лилавия чай чрез подобряване на експресията на CPT1A.