Yanjun Liu 1,2 *, Hongtao Liu 2 *, Yi Li 3,5 *, Rui Mao 2 *, Huawu Yang 1, Yuanchuan Zhang 1, Yu Zhang 2, Pengsen Guo 2, Dafang Zhan 1, Tongtong Zhang 4,5

кръгла

1. Център за затлъстяване и метаболитни заболявания, Болница за трети хора в Ченгду, Ченгду, 610031, Китай.
2. Свързана болница на Югозападния университет Jiaotong, Ченгду, 610036, Китай.
3. Отделение по радиология, Болница за трети народ в Ченгду, Ченгду, 610031, Китай.
4. Център за медицински изследвания, болница за трети хора в Ченгду, Ченгду, 610031, Китай.
5. Втората свързана болница в Ченгду, Медицински университет Чунцин, Ченгду, 610031, Китай.
* Тези автори са допринесли еднакво за тази работа.

Цитат:
Liu Y, Liu H, Li Y, Mao R, Yang H, Zhang Y, Zhang Y, Guo P, Zhan D, Zhang T. Кръгла РНК SAMD4A контролира адипогенезата при затлъстяване чрез оста miR-138-5p/EZH2. Тераностика 2020; 10 (10): 4705-4719. doi: 10.7150/thno.42417. Достъпно от https://www.thno.org/v10p4705.htm

Все повече доказателства предполагат, че кръговите РНК (circRNAs) са от решаващо значение за регулирането на генната експресия и тяхната дисрегулация е свързана с няколко заболявания. Функцията на circRNAs при затлъстяване обаче остава до голяма степен неизследвана.

Методи: Глобални промени в моделите на експресия на circRNA бяха открити в мастните тъкани, получени от затлъстели и слаби индивиди. По-специално, circSAMD4A е идентифициран като значително диференциално регулиран и е анализиран функционално, както in vitro, така и in vivo, като се използват различни подходи.

Резултати: Свръхекспресията на CircSAMD4A корелира с лоша прогноза при пациенти със затлъстяване. За разлика от това, нокдаунът circSAMD4A инхибира диференциацията в изолирани преадипоцити. При индуцирани с високо съдържание на мазнини диета (HFD), затлъстели мишки circSAMD4A обърна свързаното наддаване на тегло, намали приема на храна, намали телесните мазнини и увеличи енергийните разходи. Тези мишки също проявяват повишена инсулинова чувствителност и глюкозен толеранс. Освен това, експериментите in vitro показват, че circSAMD4A повлиява диференциацията чрез свързване с miR-138-5p и регулиране на експресията на EZH2.

Заключения: CircSAMD4A регулира преадипоцитната диференциация, като действа като гъба miR-138-5p и по този начин увеличава експресията на EZH2. Тези резултати предполагат, че circSAMD4A може да служи като потенциална цел за лечение на затлъстяване и/или като потенциален прогностичен маркер за пациенти със затлъстяване след бариатрична хирургия.

Ключови думи: circSAMD4A, затлъстяване, адипогенеза, miR-138-5p, EZH2

Затлъстяването, една от най-големите тежести за здравето в световен мащаб, е основна причина за много хронични заболявания, включително сърдечно-съдови заболявания, диабет тип 2 и рак [1,2]. Поради последните хранителни навици честотата на затлъстяването нараства [3]. Поради това за ефективното борба със затлъстяването е необходимо да се идентифицират свързаните с него молекулярни механизми и критични сигнални пътища.

Няколко проучвания подчертават регулаторните механизми, чрез които некодиращите РНК (ncRNAs), включително микроРНК (miRNAs) и дълги некодиращи РНК (lncRNAs), участват в развитието на много заболявания, като затлъстяване [4,5]. Докато miRNAs и lncRNAs бяха изследвани във връзка със затлъстяването [6,7], третият клас ncRNAs, известен като кръгови РНК (circRNAs), привлече изследователски интерес едва наскоро [8]. CircRNAs са замесени в генната регулация в голямо разнообразие от организми [9]. Въпреки това, механизмите, чрез които тези ncRNAs функционират по време на прогресирането на заболяването, не са ясно изяснени. Предполага се, че circRNAs могат да регулират генната експресия чрез различни мишени при различни видове заболявания или дори на различни етапи на заболяването [8]. Освен това, нововъзникващи доказателства предполагат, че някои circRNA действат като miRNA гъби чрез модулиране на генната транскрипция и взаимодействие с RNA свързващи протеини (RBPs) при различни заболявания, включително рак [10,11], сърдечно-съдови разстройства [12] и имуногенесценция [13]. В мастната тъкан няколко проучвания показват, че circRNAs функционират като важни регулатори в адипогенезата [14], мастното възпаление [15] и бялото мастно кафяво [16]. Въпреки това, регулаторните механизми на circRNAs в адипогенезата не са ясно разбрани.

В това проучване са конструирани профили на експресия на circRNA за проби от мастна тъкан от затлъстели и слаби индивиди, използващи circRNA микрочипове. При затлъстели индивиди circSAMD4A (hsa_circ_0004846) е значително регулиран и е свързан с прогнозата. Функционалните тестове показват, че нокдаунът circSAMD4A инхибира диференциацията на преадипоцитите. Освен това, експресията на circSAMD4A е положително корелирана с експресията на EZH2 при затлъстели индивиди. Резултатите, представени тук, показват, че circSAMD4A се свързва с miR-138-5p и действа като miRNA гъба за последващо регулиране на експресията на EZH2. Като цяло тези открития предполагат, че circSAMD4A действа и като фактор за промоция на адипогенезата и може да служи като прогностичен биомаркер за затлъстяване.

Клинични проби

Взети са проби от мастна тъкан от 40 пациенти, подложени на лапароскопско възстановяване на херния [при слаби (Ln) доброволци] и 60 пациенти, подложени на бариатрична хирургия [при затлъстели (Ob) субекти] в болница за трети народ в Ченгду, Китай между декември 2016 г. и ноември 2017 г. (Таблица S1). Според данните на Китайското национално проучване за храненето и здравето (CNNHS), ИТМ от ≥28 kg/m 2 при възрастни китайци предполага затлъстяване [17]. Анализи на микрочипове (насочени към circRNAs) бяха извършени върху тъканните проби на човека. Това проучване е одобрено от Институционалния комитет за преглед на етиката на болница за трети хора в Ченгду (запис #: 2018S75; Ченгду, Съчуан, Китай) и е проведено в съответствие с китайските етични насоки за изследване на човешки геном/ген.

CircRNA микрочипове и изчислителни анализи

Общите РНК се усвояват с Rnase R (Epicenter Technologies, Madison, WI, USA) за отстраняване на линейни РНК и обогатяване на кръгови РНК съгласно протоколите на производителя. След това обогатените кръгови РНК се амплифицират и транскрибират във флуоресцентна кРНК, използвайки метод на произволно грундиране. Белязаните cRNAs се хибридизират върху Human circRNA Array (4 × 180K, Shanghai Biotechnology Corporation, Shanghai, China), съдържащ 4 идентични масива със сонди малко под 180K. След това масивите бяха измити и сканирани с помощта на скенер Agilent и изображенията бяха анализирани с помощта на филтриране с промяна на сгъване и вулканични графики, с промяна на сгъване ≥1,5 и P-стойност 7).

Плазмидни конструкции

CircSAMD4A се амплифицира от човешката геномна ДНК и се клонира в pCD-ciR вектор (Geenseed Biotech Co, Гуанджоу, Китай), който съдържа предна кръгла рамка. Мутагенезата, насочена към сайта, беше извършена с помощта на комплект за бърза насочена мутагенеза (Takara Bio Inc., Далиан, Китай) за насочване на места за свързване на miRNA на circSAMD4A. Всички конструкции бяха потвърдени чрез секвениране.

Уестърн блотинг

Протеините се екстрахират от клетъчна линия, както и от мастните тъкани, като се използва буфер за лизис RIPA и комплектът за анализ на протеин на бицинхонинова киселина (Sigma) се използва за определяне на протеиновите концентрации. Екстрактите се разтварят чрез 12% SDS-PAGE и се прехвърлят в PVDF мембрани. След блокиране в продължение на 1 час, мембраните бяха инкубирани с първични анти-EZH2, C/EBP-α, PPAR-γ или AGO2 антитела (1: 000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) при 4 ° C за една нощ, последвано от 2 часа инкубация с конюгирано HRP вторично антитяло при стайна температура. Имунореактивните ленти бяха визуализирани с помощта на ECL и нормализирани към GAPDH (вътрешния контрол).

Флуоресцентен на място хибридизация

РНК флуоресцентна на място хибридизацията (RNA-FISH) се извършва, следвайки инструкциите на инструкциите на производителя на сондата (RiboBio, Гуанджоу, Китай; Таблица S3). Преадипоцитите се третират последователно със 70%, 85% и абсолютен етанол и се сушат при 2 ° С. След това клетките се проникват с 0,1% TritonX-100 и се инкубират с 0,02 mg/ml circSAMD4A сонда за една нощ при 37 ° С. Ядрата се оцветяват с DAPI и се наблюдава вътреклетъчна локализация на circSAMD4A чрез използване на TCS SP8 X лазерен конфокален микроскоп (Leica).

На място хибридизация (ISH)

Експресията на CircSAMD4A се изследва в мастните тъкани, като се използва ISH със специфична маркирана с дигоксин сонда circSAMD4A (Таблица S3), получена от Superchip Biotech (Шанхай, Китай). Бяха оценени нивата на оцветяване и експресия и бяха присвоени резултати. Резултатите от оцветяването на клетките се определят както следва: 10-25% оцветени, резултат = 1, 26-50% оцветени, резултат = 2, 51-75% оцветени, резултат = 3 и 76-100% оцветени, резултат = 4. Оцветяване интензивността се оценява, както следва: няма оцветяване с оценка 0, слабо оцветяване с оценка 1, умерено оцветяване с оценка 2 и силно оцветяване с оценка 3. Крайният резултат за оцветяване отразява произведението на резултата на оцветяване и оценката на интензивността на оцветяването с проби разделен на нисък израз (краен резултат ≤ 6) и група с висок израз (краен резултат> 7).

Анализ на репортер на луцифераза

Последователност от див тип circSAMD4A се клонира в вектор pmiR-RB-Report (Ribobio Co., Гуанджоу, Китай), като същевременно се генерират мутанти, използвайки насочена към сайта мутагенеза, както е описано по-горе. Мутациите бяха потвърдени чрез секвениране с вектори, съдържащи мутационна последователност, използвана като отрицателна контрола. Преадипоцитите се посяват в 96-ямкови плаки с плътност 4 × 10 3 клетки на гнездо 24 часа преди трансфекцията. След това клетките бяха трансфектирани или с див тип, или с мутирали репортерни вектори с лизати, получени на 24 h след трансфекцията. Dual-Glo Luciferase Reporter System (Promega, Madison, WI) е била използвана за извършване на теста с двойна луцифераза съгласно протоколите на производителя.

Маслено червено O оцветяване

За да се визуализират вътреклетъчни липидни отлагания, се използва оцветяване с Oil Red O. В различни времеви точки след средно променящия се див тип, преадипоцитите се оцветяват с 30% масло червено О в изопропанол в продължение на 60 минути. Използвана е светлинна микроскопия за идентифициране на липидни отлагания и потвърждаване на диференциацията.

Животни

Мъжки мишки C57BL/6J (на 9 седмици) бяха държани в съоръжение без патогени и поддържани в рамките на 12 часа цикъл светлина-тъмнина при 22 ° C. Мишките бяха хранени ad libitum с диета с високо съдържание на мазнини (HFD; TD88137 Harlan Teklad). За да се получат проби от тъкани, мишките се гладуват в продължение на 16 часа и впоследствие се анестезират с инхалационен анестетик изофлуран и се обезглавяват. Интересуващите тъкани се изрязват и се държат при -80 ° C или във формалин до анализ. Грижите за животните и експерименталните процедури са одобрени от Комитета по етика при експерименти с животни от болница в Западна Китай, Университет Съчуан, Ченгду, Китай (запис №: 2019014A).

Адено-асоциирана вирусна подготовка и инжектиране

AAV9 е проектиран да се насочва към mmu_circ_0000529 от SunBio (Шанхай, Китай) и като контрола се използва разбъркана нецелена shRNA. Последователността на mmu_circ_0000529 siRNA беше, както следва: 5'-GGCGC AAGCA CGAGA AUCAU UdTdT-3 '. Мишките се анестезират с изофлуоран (1-4%) и се поставят в легнало положение. Вирусът се разрежда в стерилен PBS (1 × 10 12 vg/ml) и се прилагат многоточкови инжекции интраперитонеално или подкожно с помощта на инсулинова спринцовка.

Тестове за глюкоза и инсулинов толеранс

Тестовете за толерантност към глюкоза и инсулин (GTT, ITT) се извършват чрез интраперитонеално инжектиране на глюкоза (2 g/kg, 20% тегл./Об. D-глюкоза [Sigma] в 0,9% тегл./Об. Физиологичен разтвор) или инсулин (0,75 единици/кг в 0,9 % тегл./об. физиологичен разтвор) на мишки, които са гладували 6 часа. Нивата на кръвната глюкоза се измерват на 0, 15, 30, 60 и 120 минути с помощта на глюкомер Infinity (US Diagnostics).

Измервания на телесна маса и състав

Мишките се претеглят на електронна везна. Съставът на тялото беше определен чрез използване на ядрено-магнитен резонанс с времева област (TD-NMR) на анализатор на постно/мазнини на Minispec Analyst AD (Bruker Optics, Silberstreifen Германия).

Разход на енергия

За измерване на приема на храна и метаболизма при мишките се използва непряка калориметрия с отворен кръг на Oxymax (16-камерна; Columbus Instruments, Columbus, OH, USA). Накратко, мишките бяха настанени индивидуално в калориметрични камери, през които въздух с известна концентрация на O2 и въздух преминаваха с постоянен дебит. Системата автоматично изтегли проби от газ и изчисли обема на консумирания O2 и обема на CO2 за всяка мишка. Разходът на топлина се измерва по време на светли и тъмни цикли, а измерванията на консумацията на храна се основават на прекъсване на хоризонтален фотолъч.

статистически анализи

Нокдаунът на circSAMD4A инхибира диференциацията на преадипоцитите

Изолирахме преадипоцит от тъканните проби на пациент със затлъстяване и извършихме нокдаун circSAMD4A, използвайки siRNAs, насочени към последователността на обратно свързване (Фигура 3D). Успешният нокдаун беше потвърден с помощта на qRT-PCR, който показа, че hSAMD4A експресията не е засегната (Фигура 3Е и S1B). Освен това, в circSMAD4A нокдаун преадипоцити, оцветяването с маслено червено О показва инхибиране на диференциацията (Фигура S2). Освен това биомаркерите за диадификация на преадипоцитите, C/EBP-α и PPAR-γ [21,22], бяха намалени в нокдаун клетки circSAMD4A, както е количествено определено чрез qRT-PCR и Western blot анализ (Фигура 3F-H).

CircSAMD4A като независим рисков фактор, който може да предскаже неремисия при пациенти със затлъстяване. (А) Експресия CircSAMD4A в мастните тъкани от 40 пациенти със затлъстяване и 20 слаби пациенти. (Б) Корелация на Пиърсън между експресията на circSAMD4A и ИТМ в мастните тъкани на 60 пациенти със затлъстяване. (° С) ROC крива за circSAMD4A, показваща неговата диагностична стойност при пациенти със затлъстяване. (Д) Схематично представяне на siRNA сайтовете, специфични за връзката на обратно свързване на circSAMD4A. (E) Експресия на circSAMD4A след лечение с siRNA с помощта на qRT-PCR. (F-G) Експресията на C/EBP-α и PPAR-y се определя количествено, използвайки qRT-PCR след нокдаун на circSAMD4A по време на диференциацията на преадипоцитите. (З.) Експресията на C/EBP-α и PPAR-y се определя количествено, като се използва Western blot анализ след нокдаун на circSAMD4A по време на диференциация на преадипоцитите. Данните са представени като средни стойности ± SD; значителна разлика е идентифицирана с t тест на Student. * Р

Получава 2019-11-24
Приети 2020-3-1
Публикувано 2020-3-26