Редактирано от Елизабет Гант, Университет на Мериленд, Колидж Парк, MD, и одобрено на 16 юли 2002 г. (получено за преглед на 3 юни 2002 г.)

мутант

Резюме

По време на жизнения си цикъл висшите растения са изложени на различни абиотични и биотични фактори на стрес, включително висока температура, суша, висока светлина и стареене. При тези условия на стрес, реактивните кислородни видове, получени от молекулен кислород (пероксид, хипероксид, хидроксилни радикали, синглетен кислород), могат да се натрупват в листата, което води до окисляване на много важни клетъчни компоненти, включително протеини, хлорофил и липиди, и накрая може да доведе до при клетъчна смърт (напр. референции 1–4). Различните биохимични редокс системи участват в реакцията на растението на оксидативен стрес - напр. Аскорбат, глутатион, салицилат и токоферол (5-8). Освен това се индуцира транскрипция на гени, свързани със стреса, което води до експресията на ензими, участващи в отстраняването на реактивни кислородни видове (9, 10). Ролята на стрес-индуцираното натрупване на специфични липиди е само слабо разбрана (11–13). За разлика от галактолипидите и фосфолипидите, които са в изобилие в растителните мембрани, различни липиди (триацилглицерол, свободни мастни киселини и токоферол) се натрупват в листата по време на стрес.

Токоферолът представлява амфифилен липид, за който се предполага, че е от решаващо значение за реакцията на оксидативен стрес в растителните мембрани (5). Хидрофилният хроманолов пръстен, който е локализиран близо до границата между липидите и водата на мембраните, обхваща хидрохиноновата пръстенна система, способна да претърпи окислително-възстановителни реакции с реактивни кислородни форми (5, 14). Въз основа на броя и разположението на метиловите групи върху хидрохиноновия пръстен могат да се разграничат четири форми на токоферол (α-, β-, γ-, δ-токоферол). В допълнение към токоферолите, токотриенолите се намират в малки количества в растителните тъкани. Токотриенолите носят ненаситена странична верига на геранилгеранил, свързана с хроманоловия пръстен, вместо наситената фитилова верига. Точната им функция при растенията е неизвестна. В експериментите in vitro е показано, че токоферолът е отговорен за отстраняването на реактивни кислородни форми, като по този начин предотвратява окислителното разграждане на мастните киселини в мембраните (15-17). Тъй като токоферолът е особено обогатен в мембраните на хлоропласта (18, 19), беше предложено да участва в защитата на хлоропластните липиди и на хлорофила срещу окислително увреждане.

Осемте различни форми на токоферол и токотриенол (обикновено наричани витамин Е) представляват съществен компонент на човешката диета, като а-токоферолът показва най-висока активност на витамин Е (20, 21). Много усилия бяха посветени на разгадаването на ролята на витамин Е по време на оксидативен стрес при животните. Подобно на растенията, се приема, че основната функция на витамин Е при бозайниците включва изчистването на реактивни кислородни видове. Недостигът на витамин Е при плъхове води до безплодие и смърт на плода (22). Въпреки това, подобно на растителната система, не са получени ясни доказателства за in vivo ролята на токоферола по време на оксидативен стрес.

Методите за биохимичен скрининг с висока производителност са успешно използвани за изолиране на растителни мутанти, засегнати в липидната биосинтеза (напр. Референции 23 и 24). Наличието на такива мутанти беше основата за изолирането на съответните гени чрез хромозомно ходене (например, референции 25 и 26). За да изясним функцията на токоферол по време на пътя на реакция на оксидативен стрес, ние инициирахме скринингов подход за растения Arabidopsis, носещи мутации в биосинтеза на токоферол. Използвайки биохимична, базирана на TLC процедура за скрининг, успяхме да изолираме мутант, напълно лишен от токоферол.

Материали и методи

Изолиране и молекулярно характеризиране на мутант с дефицит на токоферол.

Arabidopsis thaliana (екотип Col-2) M2 растения, получени от мутагенеза на етил метансулфонат, се отглеждат в почвата при стандартни условия (120 μmol⋅m −2 ⋅s −1, 20 ° C, 60% влажност на въздуха, 16 h светлина/8 h тъмно ). За да се предизвика свързаният със стреса синтез на липиди, отделените от отделните растения листа се инкубират през нощта върху мокра филтърна хартия при 37 ° С. За скрининг липидите бяха изолирани от стресирани листа с 1 M KCl/0,2 M H3PO4 и диетилетер, разделени чрез TLC върху силикагелни плаки с хексан/диетилетер/оцетна киселина (90: 10: 1, обем/обем) и оцветени с йод.

Мутантът vte1 беше четири пъти обратно кръстосан в WT Col-2, за да се намали броят на фоновите мутации. Геномна ДНК беше изолирана от F2 растения, получени от кръстосване на WT Landsberg erecta и използвана за картографиране на PCR маркери (27, 28). Генът At4g32770 на хромозома 4 (BAC F4D11, присъединителен номер на GenBank) се усилва чрез PCR от vte1 с олигонуклеотидите PD202 (AAA GGA AGG ATT TGT TTT GTT TGC GAC TG) и PD203 (GGA CCG AAC GAA CTA AAA TCA AAA TCA ) и се използва за секвениране.

Северен анализ, хетерологична експресия в Escherichia coli.

За Северния анализ, общата РНК беше изолирана от листата на WT и vte1 чрез използване на стандартни протоколи (29, 30). Блокът се хибридизира до 32 Р-маркирана At4g32770 сонда, получена чрез PCR амплификация от геномна Arabidopsis WT DNA с праймерите PD202 и PD203.

Зрялата част на протеина без очевидния сигнален пептид (31) се амплифицира чрез PCR от първоверижна кДНК, като се използват олигонуклеотидните праймери PD224 (TAA TGG ATC CAC TCC GGA CTC CTC ACA GTG G) и PD225 (GCT CAA GCT TTT ACA GAC CCG GTG GCT TGA A). PCR фрагментът се лигира в BamHI и HindIII местата на pQE31 и се прехвърля в клетки на E. coli M15 (pREP4) за експресия на протеин (Qiagen, Hilden, Германия).

Ензимен анализ.

Активността на токоферол циклазата се измерва с 2,3-диметил-5-фитил-1,4-хидрохинон (DMPQ) или 2,3-диметил-5-геранилгеранил-1,4-хидрохинон (DMGQ) (32). Реакцията на токоферол циклаза с тези субстрати доведе до синтеза на γ-токоферол и γ-токотриенол, съответно (32). Продуктите от реакцията се разделят чрез HPLC (Waters 2690) върху RP30 колона (Bischoff Chromatography, Leonberg, Германия; 230 × 4.6 mm, 3.0 μm) с изократично елуиране в 100% метанол и се откриват чрез флуоресценция (възбуждане при 295 nm; емисия при 332 nm).

Анализ на токоферол.

За GC/MS анализ листата на Arabidopsis се хомогенизират в течен азот и липидите се екстрахират със 100 μl 1 M KCl/0,2 M H3PO4 и 400 μl диетилетер. Органичната фаза се отстранява и разтворителят се изпарява в азотен газов поток. След химическа модификация с N-метил-N-триметилсилилтрифлуороацетамид, триметилсилилните производни на липидите се анализират чрез GC/MS, както е описано (33). Токоферолът се определя количествено чрез флуоресцентна HPLC със стандарти (34).

Измерване на хлорофил и хлорофил флуоресценция.

Хлорофилът се извлича от листа с 80% (обем/обем) ацетон и се определя количествено чрез измерване на абсорбциите при 646 и 663 nm (35). In vivo флуоресценцията на хлорофила се определя с флуориметър с импулсно-амплитудна модулация (PAM-2000, Heinz Walz, Effeltrich, Германия). Квантовият добив се изчислява от (Fm ′ - Ft)/Fm ′, където Ft и Fm ′ са флуоресцентните емисии на адаптиран към светлината лист под измерване на светлината или съответно след прилагане на наситен светлинен импулс (36).

Резултати

Изолиране на мутант с дефицит в синтеза на токоферол.

Избран е генетичен подход за по-нататъшно дисекция на пътя на синтеза на токоферол. Установено е, че различни неутрални липиди (свободни мастни киселини, триацилглицероли, токофероли) се натрупват по време на оксидативен стрес в листата на висшите растения (справки 11–13; фиг. 1). Увеличението на токоферол беше особено видно, тъй като количеството му в листа, изложени на стрес, беше до 5 пъти по-голямо в сравнение с контролните условия. Въз основа на тези открития е разработена процедура за скрининг на мутанти на Arabidopsis, засегнати в синтеза на токоферол. Откъснатите листа от единични растения Arabidopsis се инкубират през нощта при 37 ° C, което води до комбинация от различни фактори на стрес (т.е. топлина, нараняване). След скрининг на 2000 отделни мутантни растения Arabidopsis M2 за промени в липидния състав чрез TLC, беше идентифицирана линия с дефицит на токоферол. Тази линия беше условно обозначена vte1 (за дефицит на витамин Е).

Натрупване на неутрални липиди по време на стресови условия в листата. Растенията на Arabidopsis WT бяха изложени на различни условия на стрес (топлина, 3 дни при 37 ° C; студ, 5 дни при 4 ° C; суша, 3 дни без поливане; сол, поливане с 0,5 M NaCl в продължение на 3 дни). Липидите бяха извлечени от листа, разделени чрез TLC и оцветени с йод.

Мутантът vte1 е недостатъчен във всичките четири форми на токоферол и съдържа намалена активност на токоферол циклаза.

За да се разнищи биосинтетичният блок в vte1 мутанта, липидите бяха изолирани от WT и мутантни листа и анализирани чрез GC/MS след триметилсилилиране (Фиг. 2А). За разлика от WT, който съдържа предимно α-токоферол и малки количества от останалите три форми на токоферол (37), мутантът vte1 е напълно лишен от четирите форми на токоферол. В vte1 обаче се натрупва съединение с молекулна маса 560,5 Da, което не се открива в WT (фиг. 2А). Масовият спектър на това съединение е в съгласие с модела на фрагментация на ди (триметилсилил) производното на DMPQ (фиг. 2В). Това откритие предполага, че мутацията vte1 влияе върху активността на DMPQ циклазата (токоферол циклаза), тъй като този ензим катализира превръщането на 2-метил-6-фитил-1,4-хидрохинон и DMPQ в δ- и γ-токоферол, съответно ( Фигура 2В). Тъй като тези две форми на токоферол са предшествениците на β- и α-токоферола, се очаква намаляването на активността на токоферол циклазата да доведе до загуба и на четирите форми на токоферол.

И четирите форми на токоферол отсъстват в vte1 листата. (A) GC/MS хроматограми на триметилсилилирани липиди от листата на Arabidopsis WT и vte1. За всяка проба (WT или vte1 мутант) са представени четири следи от единичен йон за наблюдение (SIM; m/z = 560.0, 502.5, 488.5 и 474.5), получени от една GC/MS хроматограма. Сигналите се изтеглят в същия относителен мащаб (100%). (В) Съединението с време на задържане t = 46.4 минути, натрупващо се в vte1 листа, беше идентифицирано като ди (триметилсилил) производно на DMPQ въз основа на неговия фрагментационен модел. (C) Превръщането на 2-метил-6-фитил-1,4-хидрохинон или DMPQ чрез токоферол циклаза дава съответно δ- и γ-токоферол.

Ензимната активност за токоферол циклаза е измерена в екстракти от листа от WT и vte1 (Фиг. 3 А и В). Тъй като ензимните активности в растителни екстракти, използващи DMPQ или DMGQ, се оказаха много сходни (справка 32 и данните не са показани), беше използван само един от тези субстрати, DMGQ. Докато при WT голямо количество DMGQ се превръща в у-токотриенол, активността на токоферол циклазата е много ниска при vte1 (407 ± 20 и 6,6 ± 0,7 ng от γ-токотриенол на mg протеин на час за WT и vte1, съответно ). Активността на 2-метил-6-фитил-1,4-хидрохинон метилтрансферазата е много подобна при vte1 (данните не са показани). Следователно, мутацията vte1 специфично влияе върху активността на токоферол циклазата и не предизвиква общо регулиране надолу на ензимите на биосинтеза на токоферол.

Мутантът vte1 има недостатъчна активност на токоферол циклаза. (А) Токоферол циклазата катализира превръщането на DMPQ и 2,3-диметил-5-геранилгеранил-1,4-хидрохинон (DMGQ) в γ-токоферол и у-токотриенол, съответно. (B) Токоферол циклазни тестове за WT и vte1. Протеиновите екстракти се инкубират с DMGQ и реакционните продукти се отделят чрез HPLC и се откриват чрез емисия на флуоресценция. Времето на задържане на у-токотриенола беше потвърдено със стандарт. Пунктирана линия, WT; плътна линия, vte1.

Изолиране на гена VTE1.

Изолиране на гена VTE1. (А) Картографиране на мутацията vte1 към долното рамо на хромозома 4. Стойностите отгоре представляват броя на рекомбинациите между два съседни маркера в картографираща популация от 384 хромозоми. Цифрите отдолу показват позицията на физическата карта на хромозома 4 на 10 6 bp според базата данни MIPS (http://mips.gsf.de/proj/thal/). (B) Екзон/интронна структура на гена At4g32770. В vte1 този ген носи G до A точкова мутация на 3 ′ границата на интрон 3. (C) Северна анализ на общата РНК от WT и vte1. (Горна) Хибридизационен сигнал с At4g32770. (Долна) Оцветени с етидиев бромид 25S рРНК ленти.

За да се тества дали експресията на At4g32770 е променена във vte1, е направен анализ на Северна с РНК, изолирана от листа. Лента с размер около 1,6 kb, хибридизирана към сондата At4g32770 в WT, но в vte1 не се открива лента в тази позиция (фиг. 4С). Следователно, транскрипцията на At4g32770 или иРНК стабилността е силно намалена при vte1.

VTE1 кодира ензим с активност на токоферол циклаза и токотриенол циклаза.

За да се предоставят допълнителни доказателства, че протеинът VTE1 на Arabidopsis кодира функционален ензим с активност на токоферол циклаза, съответната cDNA е хетерологично експресирана в Е. coli и използвана за ензимни анализи. Протеинът съдържа очевидна N-терминална сигнална последователност за хлоропласта (справка 31; виж по-долу). Следователно, само зрялата част от протеина, в която липсва N-терминал 74аа, се използва за експресия на Е. coli. Както е показано на фиг. 5, протеинът VTE1 показва висока активност на токоферол циклаза със субстратите DMPQ и DMGQ, което води до синтез на γ-токоферол и γ-токотриенол, съответно. Тези открития предоставят ясни доказателства, че VTE1 кодира токоферол циклаза и че този ензим участва в синтеза както на токофероли, така и на токотриеноли.

Активност на токоферол циклаза на VTE1 след хетероложна експресия в Е. coli. Зрялата част на VTE1 cDNA се експресира в Е. coli и се използва за тестове за активност на токоферол циклаза с DMGQ или DMPQ. Продуктите, у-токотриенол и у-токоферол, съответно, се определят количествено чрез флуоресцентна HPLC. Стойностите представляват средните стойности на две независими измервания и стандартни грешки. Контрол, Е. coli, трансформиран с празен вектор (pQE31); VTE1, Е. coli, трансформирани с VTE1 в pQE31. Активността на токоферол циклазата на контролните клетки е под 1 ng на mg протеин на час за двата субстрата.

Мутантният фенотип vte1 по време на оксидативен стрес.

Растежът, съдържанието на хлорофил и фотосинтетичният квантов добив на vte1 при оптимални условия бяха много подобни на WT. По същия начин, мутантът на хомогендизат фитилтрансфераза на Synechocystis с дефицит във всички форми на токоферол не е намален в растежа или съдържанието на хлорофил (38). Въпреки това, по време на фотооксидативен стрес, съдържанието на хлорофил и квантовият добив са намалени в vte1 в сравнение с WT. Този резултат е в съгласие с предполагаемата роля на токоферола в защитата на фотосинтетичните комплекси в тилакоидите от оксидативен стрес. Въпреки това, предизвиканите от стреса промени, наблюдавани за vte1, бяха доста малки. Следователно, други редокс системи (напр. Аскорбат, глутатион, каротеноиди) могат да участват в отстраняването на реактивни кислородни видове при условия на висока светлина.

Намаляването на активността на геранилгеранил редуктазата чрез антисенс експресия в растенията на тютюн също води до частично намаляване на синтеза на токоферол (44, 45). Подобно на мутанта Arabidopsis vte1, само при условия на оксидативен стрес е засегната фотосинтезата в трансгенните тютюневи линии. Въпреки това, за разлика от vte1, който се влияе изключително при синтеза на токоферол, биосинтезата на хлорофил в антисенсните растения на геранилгеранил редуктаза също е намалена. Следователно не беше ясно дали фенотипичните промени, наблюдавани за тютюневите антисмислени линии, се дължат на дефицит на токоферол или хлорофил. Подобно на vte1, мутант на Arabidopsis с дефицит в синтеза на аскорбат (soz1/vtc1) показва повишена чувствителност към стрес от околната среда (46). Двата мутанта, vte1 и vtc1, отварят пътя за изследване на in vivo ролята на витамин Е и витамин С по време на оксидативен стрес при висши растения.